论文部分内容阅读
糖类与核酸、蛋白质、脂质并称为四大生物大分子。人体内糖基化修饰广泛参与包括信号传导在内的各项生理活动。糖类物质的代谢与受精过程、细胞分化、组织发育、免疫作用、神经系统的形成和细胞癌变等生命现象息息相关。细胞糖链结构的探索研究对理解糖链相关的生物代谢过程具有重要意义。与蛋白质和核酸相比,糖链结构复杂多变,这为糖链结构的鉴定增加难度。虽然此前预测糖链结构的相关研究降低了糖链鉴定的难度。然而这些研究仍然存在一些局限性,例如目前对于糖链结构预测的研究只停留于评估特定的糖基化修饰通路,如N-糖基化,缺乏对于整个细胞内错综复杂的糖基化修饰的全局预测。此外这类研究并未应用于人体细胞的糖基化水平分析。因此亟需开发一种更简便的分析工具,用于人体细胞糖链结构系统性的预测研究。近年来高通量测序（RNA-seq）技术逐渐成熟,利用基因转录数据进行代谢水平的预测成为可能。为了解决糖链分析研究领域的难题,本研究以HEK293为模式细胞,整合转录信息到糖基化代谢通路,将糖基化过程可视化,并探索利用转录信息预测糖链结构的新方法。本研究的目的是开发一种简单易懂的糖基化代谢通路可视化工具,构建鸟瞰式的评估体系,综合预测人类衍生细胞中糖基化基因转录水平差异对糖链结构的影响。主要研究结论如下:（1）本研究基于最新的文献报道收录951个糖基化相关基因,根据糖基化基因涉及的生物学功能分为30类,并绘制19类糖基化代谢谱图。进一步开发并构建了自动化绘图网络工具。该工具整合糖基化基因表达谱到代谢通路图中,使用箭头样式表示相关基因参与糖基化反应的详细信息,实现对糖链代谢过程的可视化,直观描述具体糖链结构的合成潜力。利用该分析工具发现HEK293细胞糖基化代谢通路图中的糖链结构与已报道的细胞糖基化能力基本一致。（2）在HEK293细胞的质谱和凝集素染色鉴定中,证实HEK293细胞能够完成多种糖基化修饰。在末端修饰糖链表位的研究中,证实代谢通路上转录丰度过低的糖基转移酶基因对糖链结构起到决定性作用。在O-糖合成途径相关的研究中发现预测结果高度拟合质谱鉴定的糖链结构种类,能够准确预测糖链合成的潜力。对人类衍生型细胞的糖基化基因表达数据库和已报道的糖链鉴定结果进一步分析,发现当预测阈值TPM为1时,本研究的预测工具能够广泛应用于人类衍生型细胞的糖链预测工作。（3）本研究使用凝集素染色技术对40株N-糖链合成缺陷的敲除细胞系组成的细胞库进行检测,证实凝集素染色分析能够捕捉到敲除细胞表面糖链结构的变化。研究发现表达高甘露糖型N-糖链的敲除细胞系表面的糖链表现出高度聚类,而且末端修饰结构中只有聚乳糖胺修饰异常上调。对其中7种具有代表性的N-糖合成相关基因缺陷型细胞系的质谱分析发现,生产高甘露糖型N-糖链的细胞系T-KO和MGAT1-KO的糖脂组分发生显著改变。通过对转录组数据的分析,发现T-KO中多个糖基化基因受到转录调控,并找到了T-KO细胞中表型发生改变的潜在原因:神经酰胺合成酶基因（CERS1）、透明质酸合成酶2基因（HAS2）、N-乙酰葡糖胺差向异构酶基因（RENBP）等转录水平显著上调。基于上述发现,本研究使用瞬时荧光定量PCR（RT-q PCR）验证了T-KO细胞中上述基因的转录上调。在随后的深入研究中发现,CERS1基因转录水平的上调增加了对应脂质底物的合成;HAS2的转录水平上调增强了细胞向胞外释放透明质酸的能力;RENBP转录水平的上调促进了Glc NAc转化为Man NAc的异构作用。结合T-KO细胞中N-糖链末端不能被修饰这一特征,本研究发现由于糖核苷酸底物UDP-Glc NAc不能被N-糖链利用而积累导致细胞压力。细胞通过适应性转录调控机制,上调HAS2、CERS1和RENBP等基因的转录水平,从而改变糖核苷酸底物的消耗途径,降低细胞内UDPGlc NAc或Glc NAc含量。（4）本研究将人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas,HPA）数据库中肝脏和小肠的转录组信息输入到糖基化代谢通路可视化工具中,证实了由于大量关键的糖基转移酶转录量低,糖基化过程受到限制。因此,肝脏细胞内O-糖种类较单一,以核心1结构及唾液酸修饰的结构为主。然而,在粘蛋白表达能力强的消化功能相关的器官小肠内,绝大多数糖基转移酶的高度表达是O-糖链结构种类丰富多样的主要原因。在37种人类组织器官O-糖相关基因的表达谱分析发现,在功能类似的器官中,如消化器官的转录模式趋近而聚类,揭示了O-糖链合成中关键糖基化酶蛋白的高度表达对消化道相关器官中O-糖链结构丰富度和复杂度的贡献。在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas Program,TCGA）数据库和基因型组织表达数据库（The Genotype-Tissue Expression project,GTEx）中人类结肠样本的转录组测序数据的分析中,成功地预测出癌变过程中糖基化修饰水平的改变。本研究工作收录了涉及糖基化的基因,通过代谢谱图描绘人类细胞糖基化过程中的详细信息,证明了转录组信息能够用于糖链结构的预测。同时转录分析能够敏锐地捕捉到细胞内受到转录调控的糖基化基因,对细胞内糖链组分发生的改变作出解释。此外本研究的网络工具可用于人类衍生型细胞的糖基化水平的预测,一方面揭示细胞分化过程中糖基化基因表达谱的改变,从而形成与器官功能相适应的糖基化差异;另一方面能够预测如癌变等病理过程前后的糖链结构变化。这一研究有望在未来为疾病的治疗和生物标记物的发现提供新思路。