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葡萄风信子(Muscari spp.)是一种多年生单子叶球根观赏植物,花色以不同程度的蓝色为主、还有粉色、白色品种,因其具备简单的花色遗传背景,是研究单子叶植物花色育种的好材料。课题组前期研究表明葡萄风信子花色形成主要与类黄酮化合物有关,并提出假说:黄酮醇合成酶(Ma FLS)通过与二氢黄酮醇-4-还原酶(Ma DFR)竞争同一底物二氢黄酮醇从而通向黄酮醇和花青素两个支路,二者共同参与调控蓝、白葡萄风信子花色的形成。目前对蓝、白葡萄风信子花色相关的关键基因的克隆及功能验证已有研究,但在转录调控方面如何调控花色形成机理尚不明确。本研究以蓝色葡萄风信子‘黑眼睛’(M.aucheri‘Dark Eyes’)和白色葡萄风信子‘白丽人’(M.aucheri‘White Beauty’)为材料,针对黄酮醇支路上重要催化剂FLS基因及其启动子进行克隆及功能研究,主要取得以下研究结果:1.从葡萄风信子‘黑眼睛’中克隆得到一条新的FLS基因,命名为Ma FLS1。Ma FLS1基因编码区全长999 bp,编码332个氨基酸,登录号MT198683,蛋白分子量为36.96k Da,不稳定系数为40.68,预测分析属于不稳定蛋白;Ma FLS1蛋白不具有信号肽,不是分泌蛋白。2.氨基酸比对分析表明:Ma FLS1与Ma FLS氨基酸序列同源性为93.43%,与洋葱Ac FLS-HRB和Ac FLS-H6的相似性分别为71.04%和70.75%、中国水仙Nta FLS的相似性为72.54%、龙胆Gt FLS相似性为65.07%等。系统发育分析表明,Ma FLS1聚类在单子叶植物家族中,并且与葡萄风信子Ma FLS、中国水仙Nta FLS进化关系最近。3.Ma FLS1的时空表达模式分析表明,Ma FLS1的表达具有组织特异性,在葡萄风信子的根茎叶中几乎不表达,在花中S1时期(花蕾刚形成)高表达,在S2时期(花蕾开始着色)表达量逐渐下降,此后随着花的发育该基因表达相对较低至不表达。与课题组前期研究‘白丽人’Ma FLS基因表达趋势基本一致。4.采用染色体步移法克隆得到蓝白Ma FLS基因启动子p HFLS(1257 bp)、p BFLS(603 bp)。生物信息学分析显示p HFLS、p BFLS两启动子序列一致性为26.08%。除相同位置共同存在2个CAAT-box、1个TATA-box、1个G-box元件外,两启动子在转录因子结合位点元件及其它顺式作用元件位置和数量上存在较大差异:p HFLS单独存在4个CAAT-box、3个光响应元件G-box、1个I-box、1个ACE、1个顺式作用监管元件A-box、4个TATA-box、1个转录因子结合位点元件MYB、1个转录因子结合位点元件MYb;p BFLS单独存在2个TATA-box、3个CAAT-box、2个转录因子结合位点元件MYC。5.根据启动子序列上顺式作用元件所在位置,将启动子从5’端逐段进行缺失,构建p HFLS、p BFLS启动子全长及缺失片段融合报告基因表达载体,转化农杆菌GV3101并瞬时转化本氏烟草,对烟草叶片进行GUS组织化学染色分析得出,p HFLS、p BFLS启动子均有表达活性,且p BFLS启动子活性较强。p HFLS启动子活性的关键元件位于-548～-224 bp区域;p BFLS启动子活性的关键元件位于-223～-86 bp区域。6.构建p HFLS、p BFLS启动子全长与GUS基因融合表达载体,转化农杆菌GV3101并遗传转化烟草SR,对转基因植株不同组织进行GUS组织化学染色,结果表明,p HFLS、p BFLS启动子均在烟草盛花期的花药部位集中表达,且p BFLS启动子活性较强。结合葡萄风信子FLS基因表达模式,推测该基因启动子在花初期花瓣中也有所表达,本研究暂未检测到。初步推定p HFLS、p BFLS启动子为花组织特异性启动子。