研究背景目前世界卫生组织确认的罕见病种类有7000多种,其中80%是由于基因缺陷导致的遗传性疾病。我国罕见病患者基数庞大,预估超过1000万,且每年新增患者超过20万。然而,我国在该领域的基础研究相对薄弱,对“孤儿药”的研发仍处于一片空白。相较常见的无明确遗传规律的散发型疾病,单基因遗传病在许多生命科学重大问题的研究上具有非常重要的意义。科凯恩氏综合征（Cockayne’s Syndrome）是一种罕见的儿童神经系统发育障碍疾病,为单基因（CSA或CSB）突变导致的常染色体隐性遗传病,多起病于婴幼儿时期,主要表现为明显的光照过敏、严重的生长迟缓、神经发育障碍和多器官系统发育异常。根据临床特征、发病时间及严重程度可以将CS（Cockayne’s Syndrome）病人大致分为三种类型,包括出生后两年内出现症状的Ⅰ型（又称经典型）;比Ⅰ型更早发病且症状更严重的Ⅱ型;症状轻微,起病较晚的Ⅲ型。无论哪种亚型,科凯恩氏综合症病人都会表现出不同程度的大脑发育异常,包括脑组织发育迟缓,伴神经功能退化和认知功能下降;病理上主要表现为显著的脑萎缩、髓鞘减少、钙化、神经元变性等。科凯恩氏综合征主要是由于ERCC8（CSA）或ERCC6（CSB）基因突变引起的,CSA和CSB蛋白参与转录偶联核苷酸切除修复通路（TC-NER）,TC-NER通路的缺陷导致CS患者出现皮肤光过敏及紫外线照射后新生RNA合成障碍。因此,传统观点认为CS是一种转录偶联核苷酸切除修复缺陷疾病。但是,这只能解释CS的光过敏表型,而不能解释严重的神经系统症状和各系统的早衰等。目前科凯恩氏综合征发病机制仍然不清楚。迄今为止,研究CS的小鼠模型包括Csa或Csb基因缺陷的小鼠,这些小鼠普遍表现出对紫外的敏感性、转录偶联修复的缺陷、紫外诱导后新生RNA合成障碍,以及轻度的神经系统症状和生长障碍,但没有发展出严重的神经系统障碍及早衰等,无法模拟CS病人的神经病理特征。因此,改良现有小鼠模型或构建新的大鼠模型对于研究其发病机理和验证新的分子机制具有重要意义。研究目标构建科凯恩氏综合征疾病大鼠模型,并初步评估其在DNA损伤修复及神经系统发育方面的表型。研究方法第一部分:运用CRISPR/Cas9技术构建CSB敲除大鼠,并通过PCR和Sanger测序对大鼠进行基因分型。随后,通过western blot和q PCR验证CSB敲除大鼠在蛋白水平和转录水平CSB基因的表达情况。最后,通过全基因组测序验证打靶和脱靶情况。第二部分:通过一系列实验评估CSB敲除大鼠原代成纤维细胞的DNA损伤修复能力:利用UV照射前后细胞的生长曲线实验和克隆形成实验评估光敏感性,通过CPD实验评估转录偶联核苷酸切除修复能力,通过EU实验评估转录恢复情况,通过Ed U实验评估全基因组核苷酸切除修复能力,通过KBr O3处理后克隆形成实验评估碱基切除修复能力,通过q PCR验证线粒体DNA和线粒体DNA聚合酶POLG1的表达来评估线粒体受损情况。第三部分:通过一系列实验评估CSB敲除大鼠的神经系统发育情况:通过对脑组织HE染色评估大脑和小脑整体发育情况,通过对小脑皮质免疫组织化学Calbidin染色标记浦肯野细胞评估是否存在神经元丢失,通过对小脑白质免疫荧光实验检测neurofilament和MBP来评估轴突和髓鞘形成情况,通过对脑组织HE染色和免疫荧光Collagen IV染色来检测是否出现钙化,通过大脑组织免疫荧光实验标记γH2AX检测是否出现DNA损伤。研究结果第一部分:运用CRISPR/Cas9技术成功构建CSB敲除大鼠模型,并且大鼠CSB基因在转录水平和蛋白水平几乎没有表达,全基因组测序也没发现脱靶现象。第二部分:UV照射的细胞生长曲线实验和克隆形成实验显示,和对照组相比,UV照射后,CSB敲除大鼠原代成纤维细胞在5J/m2的低剂量时存活率下降至10%以下,也无法形成克隆,表现出对紫外高度敏感;CPD实验结果显示,和对照组相比,CSB敲除大鼠原代成纤维细胞对UV照射后形成的CPD基本没有修复,表明CSB敲除大鼠转录偶联核苷酸切除修复通路障碍;EU实验结果显示,和对照组相比,CSB敲除大鼠原代成纤维细胞UV照射后新生RNA合成障碍;Ed U实验结果显示,CSB敲除大鼠原代成纤维细胞的UDS水平和对照组无明显差异,表明敲除CSB基因对全基因组核苷酸切除修复通路无影响;KBr O3处理后克隆形成实验结果显示,CSB敲除大鼠原代成纤维细胞在5m M低浓度时也无法形成克隆,表明其碱基切除修复能力受损;线粒体DNA和线粒体DNA聚合酶POLG1的q PCR实验结果显示,CSB敲除大鼠原代成纤维细胞线粒体DNA和线粒体DNA聚合酶POLG1表达均有不同程度的下降,表明其线粒体有不同程度的受损。第三部分:HE染色实验结果显示,和对照组相比,CSB敲除大鼠小脑明显萎缩,并出现了脑叶缺损,大脑海马齿状回出现了发育畸形;免疫组化结果显示,CSB敲除大鼠浦肯野细胞数量明显减少,密度降低且排列无序,表明CSB敲除大鼠出现一定程度的神经元丢失;免疫荧光实验结果显示,CSB敲除大鼠神经丝蛋白（neurofilament）表达量明显下降,髓鞘碱性蛋白（MBP）数量减少、排列紊乱,表明CSB敲除大鼠神经元轴突数量减少且发生变性,髓鞘形成障碍;CSB敲除大鼠的脑组织HE染色实验显示大脑和小脑均未出现钙化小晶体,免疫荧光实验显示大脑血管周围未见Ⅳ型胶原蛋白表达,表明CSB敲除大鼠脑组织并未出现钙化;CSB敲除大鼠大脑免疫荧光实验显示未出现γH2AX荧光,表明CSB敲除大鼠并未出现累积的DNA损伤。研究结论1)运用CRISPR/Cas9技术成功构建CSB基因突变的Cockayne综合征大鼠模型。2)Cockayne综合征大鼠模型呈现出DNA损伤修复障碍。3)Cockayne综合征大鼠模型呈现出不同程度的神经发育障碍。4)CSB突变大鼠可以很好地模拟病人的临床症状,尤其是神经病理特征,为科凯恩氏综合征的临床诊治提供了理想而全新的动物模型。