分泌表达纤维素酶EGA的重组枯草芽孢杆菌构建及其高密度发酵

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地球上存在着非常丰富的纤维素物质,而纤维素酶在将纤维素物质降解成简单糖进而转化为能源物质的过程中起到了关键的作用。利用基因工程及微生物发酵技术大规模生产纤维素酶来降低纤维素酶的生产成本,将具有巨大的应用价值。枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis是一种高效的外源蛋白表达菌株,它能将目的蛋白分泌到细胞外的培养基中。由于该菌株具有非致病性、高表达、外分泌、抗逆性强等特点,枯草芽孢杆菌已受到越来越多的关注,也必将成为表达外源基因最具潜力的宿主菌之一。本研究从福寿螺胃液共生菌株Bacillus sp.Strain AC-1基因组中成功克隆了纤维素酶EGA的基因序列,并利用基因工程技术构建了纤维素酶EGA的重组枯草芽孢杆菌表达载体pAUsp-ega。该载体含有一个强启动子和一段信号肽,经淀粉诱导能表达外源蛋白。利用响应面法对分泌表达纤维素酶EGA的重组枯草芽孢杆菌的培养条件及产酶条件进行优化。通过单因素试验和Plackett-Burma实验筛选出影响产纤维素酶EGA表达的主要显著因素为可溶性淀粉,酵母粉和MgSO4·7H2O。然后通过Box-Behnken实验对这三个显著因素进行优化,利用响应面模型分析预测出最佳发酵条件,并对其进行发酵罐扩大培养。以枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失型菌株WB700为宿主菌,表达得到的重组纤维素酶EGA以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物得到的培养基上清酶活力达到1264U/L。纤维素酶EGA在pH6.0表现出最高水解活力,最适反应温度为60oC,在酸性条件下稳定性良好。本研究构建了一个新的枯草芽孢杆菌表达系统,具有一定的创新性。在充分利用自然界可再生纤维素物质的过程中,降低纤维素酶的商业成本是关键问题,因此本研究具有重要意义和应用价值。本研究还对纤维素酶EGA的发酵酶液做了酶学性质的分析,为今后从分子水平以及发酵水平上提高纤维酶EGA产量,以及对纤维素酶EGA进行酶学性质分析和酶的晶体结构分析都提供了一个很好的平台。
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