第一部分人乙肝炎相关肝硬化组织中肝前体细胞增殖与乙肝病毒标志物的关系　　 背景和目的:人乙肝相关肝炎肝硬化的发生发展过程中,肝前体细胞增殖活化。肝前体细胞为一细胞群,即单个肝前体细胞(IPCs),反应性非典型胆小管和中间型肝细胞。IPCs向胆系细胞方向分化形成反应性非典型胆小管,通过中间型肝细胞向肝细胞方向分化。至今,肝前体细胞增殖分化的机制了解甚少。本文旨在研究乙肝相关肝硬化组织中肝前体细胞增殖程度与炎症活动度、肝细胞内乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)、血清乙肝核心抗原(HBeAg)以及HBV DNA载量间的关系,初步探讨乙肝病毒基因产物在肝前体细胞增殖分化中的作用。　　 方法：对116例乙肝相关肝硬化标本进行炎症程度评分,并用胆管上皮细胞标志物细胞角蛋白7(cytokeratin7,CK7),对IPCs、中间型肝细胞以及反应性非典型胆小管分别进行计数和半定量评分。免疫组织化学法检测肝细胞内HBsAg和HBcAg的表达强度与表达方式,并测定血清HBeAg及HBV DNA载量。　　 结果：　　 1.IPCs数目、中间型肝细胞数目以及反应性非典型胆小管反应程度均与炎症活动度正相关(rs=0.793,P=0.000；rs=0.611,P=0.000；rs=0.699,P=0.000)。　　 2.HBcAg在肝细胞内表达分为浆膜表达(浆膜型组)、核表达(核型组)及两者混合表达(混合型组)。HBcAg浆膜型组和混合型组的IPCs数目、中间型肝细胞数目、反应性非典型胆小管反应程度以及炎症活动度均高于核型组和阴性组。　　 3.IPCs数目、中间型肝细胞数目、反应性非典型胆小管反应程度及炎症活动度与HBcAg浆膜表达强度正相关(rs=0.620,P=0.000；rs=0.537,P=0.000；rs=0.486,P=0.000；rs=0.655,P=0.000),而与核表达强度无关。　　 4.IPCs数目、中间型肝细胞数目、反应性非典型胆小管反应程度以及炎症活动度在HBsAg不同表达强度组间均无显著差异。　　 5.IPCs数目、中间型肝细胞数目、反应性非典型胆小管反应程度以及炎症活动度在HBeAg阳性组和阴性组间均无显著差异。　　 6.IPCs数目、中间型肝细胞数目、反应性非典型胆小管反应程度以及炎症活动度在不同HBV DNA载量组间均无显著性差异。　　 结论：　　 1.乙肝相关肝硬化组织中,肝前体细胞增殖与炎症活动度呈正相关关系,提示乙肝病毒促发的炎症可能引起肝前体细胞的增殖。　　 2.乙肝相关肝硬化组织中,肝前体细胞增殖与肝细胞内HBcAg浆膜表达强度呈正相关关系,提示HBcAg整合至肝细胞内后,至浆膜表达期时,肝内炎症反应增强从而诱发肝前体细胞增殖。　　 3.乙肝相关肝硬化组织中,肝前体细胞增殖与肝细胞内HBsAg的表达强度无相关关系,提示HBsAg对肝前体细胞增殖并不重要。　　 4.肝前体细胞增殖与乙肝病毒复制水平无关。　　 第二部分乙肝相关肝硬化组织中肝前体细胞(反应性非典型胆小管)基因表达谱的构建及CNTNAP2在肝前体细胞中的表达　　 背景和目的:目前反应性非典型胆小管尚缺乏特异的分子标记,分离培养存在较大难度。关于反应性非典型胆小管的大部分研究仍主要集中于针对单个基因的免疫组化的研究。激光显微切割技术能从复杂的组织中获取较纯的目的细胞进行下游DNA、RNA和蛋白质的研究。激光显微切割联合基因芯片技术则可从整体水平研究反应性非典型胆小管的基因表达谱,对筛选分子标记物具有重要的指导意义。　　 方法：　　 1.应用激光捕获显微切割技术获取乙肝相关肝癌旁肝硬化组织中反应性非典型胆小管和正常肝组织中小叶间胆管,提取RNA,体外线性扩增,与人类全基因组寡核苷酸芯片Affymetrix HG U133 Plus2.0芯片杂交,构建5例反应性非典型胆小管与3例小叶间胆管的全基因组表达谱。　　 2.利用随机方差模型的t检验,对反应性非典型胆小管与小叶间胆管间的差异基因进行筛选,并对差异基因利用Onto-Express进行GO分类。　　 3.选择在反应性非典型胆小管中上调表达的部分候选靶基因进行qRT-PCR,检测基因的表达情况。　　 4.免疫组化验证候选靶基因在30例乙肝相关肝癌旁肝硬化标本及20例单纯肝硬化标本中表达情况,并联合多种肝前体细胞标记物(Heptocyte,CK7,CK19,c-kit),观察其表达与肝前体细胞增殖的关系。　　 结果：　　 1.通过癌旁肝硬化组织中反应性非典型胆小管和正常肝组织中小叶间胆管基因表达谱的比较,筛选出在反应性非典型胆小管中上调表达基因88个(上调倍数大于2.5,P<0.05)。　　 2.从筛选出来的差异基因对G0分类中生物学过程进行分析,发现在反应性非典型胆小管中上调基因主要参与细胞粘附、免疫反应和代谢过程等。　　 3.选择在反应性非典型胆小管中上调表达的3个靶基因(CNTNAP2、LAYN及LGALS1)进行qRT-PCR,三者均表现为上调,与基因芯片表达结果一致。　　 4.免疫组化显示CNTNAP2在乙肝相关肝硬化组织中部分反应性非典型胆小管及单个肝前体细胞上表达,在中间型肝细胞及正常胆管上皮细胞上未见表达。　　 结论：　　 1.首次利用激光显微切割联合基因芯片技术,成功的研究了反应性非典型胆小管的基因表达谱,结果发现有88个基因在反应性非典型胆小管中上调表达,这些上调基因主要与细胞粘附、免疫反应和代谢过程有关。　　 2.首次发现CNTNAP2在部分肝前体细胞及反应性非典型胆小管亚群上表达,表明CNTNAP2可能是肝前体细胞增殖分化过程中的一个重要基因分子,其可能作为一个新的分子标记物用于肝前体细胞的后续研究。