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门多萨假单胞菌NK-01 (Pseudomonas mendocina NK-01)是一株可以利用葡萄糖作为单一碳源,同时合成中长链聚羟基脂肪酸酯(Medium-chain-length polyhydroxyalkanoates, PHAMCL)以及褐藻寡糖(Alginate Oligosaccharides, AO)的革兰氏阴性菌。目前,有关PHA与褐藻寡糖的合成途径已经阐明,并且已经对该菌株进行了全基因测序。但对基因组信息进行分析后发现,在P. mendocina NK-01的基因组中存在着大量冗余的非必需基因以及基因组岛。本研究旨在建立一种无痕的基因敲除体系,利用基因敲除的方式对基因功能进行研究。为基因组精简进行研究。upp基因是尿嘧啶磷酸核糖转移酶(uracil phosphoribosyltransferase, UPRTase)的编码基因,也是现阶段广泛应用于基因无痕敲除系统中的一种反向筛选标记,利用微生物自身upp基因的缺失对5-氟尿嘧啶产生抗性,从而实现目的片段的敲除。本研究根据上述原理,在P. mendocina NK-01中建立了upp反向筛选标记结合自杀质粒的无痕基因敲除系统,成功敲除褐藻寡糖合成相关基因algA,并对P. mendocina NK-01基因组进行了部分基因敲除,大小分别为8kb、9kb、10kb、 32kb、41kb以及51kb,共151kb,占全基因组序列的3%,从而对敲除系统进行了可行性的验证,进一步为P. mendocina NK-01基因组的精简奠定了基础。另外,本实验还对上述所构建的基因突变菌种进行了生长状况、摇瓶发酵、分批发酵以及相关产物的研究及测定。与野生型相比,ΔalgA基因突变菌株P.mendocina NK-01 ΔalgA生长情况与野生型类似,但PHA产量有一定的提升,为0.330g/L,是野生型的1.4倍。然而,精简了151kb的突变菌株P. mendocina NK-01Δ151,生长状况以及产物产量都有所下降,褐藻寡糖与PHA的产量分别为0.258g/L以及0.160g/L(野生型P. mendocina NK-01褐藻寡糖产量为0.335g/L,PHA产量为0.231g/L)。但上述两种基因突变菌种所合成的PHA的结构与物理性质并没有发生改变。