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目的:兴奋性毒性是导致神经退行性疾病神经元细胞大量丢失的主要原因。海人藻酸(Kianic acid,KA),兴奋性神经递质谷氨酸(glutamate)类似物,其诱导的神经元兴奋性毒性损伤被认为是研究神经退行性疾病的经典体内及体外模型。小胶质细胞是中枢神经系统的原始免疫细胞,发挥免疫监视、免疫调节及维持内环境稳态的等重要功能。其激活后具有两种细胞表型(M1型和M2型),在神经退行性疾病中发挥双重作用。M1型,即传统经典型小胶质细胞,在炎症反应进展期产生并聚集,分泌大量促进炎症细胞因子,对中枢神经系统产生促进炎症的作用;M2型,即选择性小胶质细胞,炎症初期和恢复期产生,可吞噬病原、分泌大量抗炎症细胞因子,促进组织修复,对受损的神经元起到保护作用。将M1型小胶质细胞转变为M2型小胶质细胞可以逆转神经退行性疾病的预后。本研究诣在探索M2型小胶质细胞在KA诱导的神经退行性改变中保护性作用的机制。方法:取C57BL/6胎鼠(E16)海马及大脑皮层神经元和新生鼠(0-2天)皮层小胶质细胞并分别进行原代培养。将小胶质细胞分为不同亚型:M0(原代小胶质细胞)、Ml(M0细胞经脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)+干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)刺激极化)及M2(M0细胞经白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)+IL-10+转移生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)刺激极化)。应用流式细胞技术分离不同表型小胶质细胞并检测不同表型小胶质细胞标志物的表达水平。原代培养的神经元细胞分别与3种细胞表型的小胶质细胞共培养,并以KA刺激24小时(h)。分析KA刺激前及刺激后单纯神经元培养组(N)和神经元与每种小胶质细胞亚型共培养组(N+MO、N+Ml、N+M2)的细胞存活率、培养液上清中一氧化氮(NO)水平和乳酸脱氢酶(LDH)产量、检测培养液上清中不同类型(促炎症和抗炎症)的细胞因子水平、核因子κκB(nuclear factor κB,NF-κB)和caspase3的表达水平。所有数据均为平均值±标准差,差异以T检验或方差分析计算。配对T检验用于分析单纯神经元培养的数据,Tukey检验后单因素方差分析用于分析流式细胞仪检测结果,benferoni posttes的多因素方差分析用于分析小胶质细胞不同细胞表型与神经元共培养后的检测结果。P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果:(1)KA刺激后神经元显著损伤:KA刺激后,神经元细胞形态发生明显改变,细胞存活率显著降低、NO和LDH水平明显升高(P<0.05,n=3);(2)M1型小胶质细胞加剧了 KA诱导的神经毒性损伤而M2型小胶质保护KA诱导后受损的神经元:①KA刺激后,M1型小胶质细胞与神经元共培养组(N+M1)与单纯神经元培养组(N)比较神经元存活率进一步下降(P<0.05,n=3),M2型小胶质细胞与神经元共培养组(N+M2)与N相比神经元存活率则明显升高(P<0.05,n=3);②KA诱导后,M1型小胶质细胞与神经元共培养组(N+Ml)NO产量比M0和M2型小胶质细胞与神经元共培养组((N+M0)和(N+M2))显著升高(P<0.001,n=3);③KA诱导后,M1性小胶质细胞与神经元共培养组(N+M1)促炎症细胞因子TNF-α、IL-6表达水平较M0和M2型小胶质细胞共培养组((N+M0)和(N+M2))明显升高,(P<0.001,n=3);④KA刺激后与KA刺激前相比,M2型小胶质细胞与神经元共培养组(N+M2)促炎症细胞因子IFN-γ表达量明显降低(P<0.01,n=3);(3)KA刺激后,M2型小胶质细胞与神经元共培养组(N+M2)NF-κB和caspase3的表达水平比M0和M1型小胶质细胞与神经元共培养组((N+M0)和(N+M1))显著下降(P<0.05,n=3)。结论:(1)海马及大脑皮层神经元经KA刺激后可以获得稳定的神经毒性损伤模型;(2)M1型小胶质细胞对KA诱导神经毒性损伤起促进作用,M2型小胶质细胞则发挥相反作用;(3)M2型小胶质细胞通过下调NF-κκB和caspase3信号通路保护神经元免于KA诱导的神经毒性反应。