猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。中国自1996年爆发PRRS以来，已遍及全国各地，成为对养猪业危害最为严重的疫病之一。PRRS的病原体为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组大小约为15.5kb，包含10个开放阅读框，属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属成员。PRRSV具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、持续感染性以及抗体依赖性增加作用等特征。临床上常与其它病原混合感染。现在用于预防PRRS的灭活疫苗效果不稳定，常导致免疫失败；而弱毒疫苗有毒力返强的危险，可能会导致疫苗毒的传播。PRRSV N蛋白是由ORF7编码的核衣壳蛋白，占整个病毒粒子蛋白总量的20-40%，是病毒装配和拆分的主要结构蛋白，在PRRSV感染细胞中，表达量最高，抗原性最强，直接参与病毒基因组的复制。同时，N基因在PRRSV RNA的识别、亚细胞定位、与其他病毒和细胞蛋白的互作中起到重要作用。一旦N基因发生变异或受到抑制，往往会导致整个病毒基因组功能的丧失。GP5蛋白是由ORF5编码的糖基化囊膜蛋白，具有较好的免疫原性，能够诱导机体产生中和抗体，在PRRSV的致病性、诊断、预防与控制方面具有重要意义，是研制基因工程疫苗的最佳候选基因。但是，在GP5蛋白的外结构域中有一个高度保守的线性中和表位B（Aa37-45）和一个高度变异性的免疫优势非中和表位A（Aa27-31）。A表位的核心位于B表位的七个氨基酸之前，这一特点使A表位成为一个“诱骗”表位，当AB表位同时存在时，B表位的中和作用会被A表位完全覆盖，降低中和反应。这一现象称为抗体依赖性增强作用，即ADE效应。本课题结合N蛋白及GP5蛋白的特点，利用RNAi技术靶向N基因，筛选出3个高效靶位（71-91，144-164，218-238），构建shRNA干扰质粒，分别命名为p2.1-N71、p2.1-N144及p2.1-N218，在MARC-145细胞上通过细胞CPE观察，病毒滴度测定，间接免疫荧光检测，以及实时荧光定量PCR技术验证RNAi靶向N基因抑制PRRSV的复制效果。结果表明，构建的三个shRNA干扰质粒均能有效的抑制PRRSV的复制，它们可以阻止MARC-145细胞CPE的形成，能够降低病毒滴度874-倍、151-倍、和592-倍，并且，实时荧光定量PCR结果显示，三个shRNA干扰质粒能够分别使PRRSV在MARC-145细胞中的复制减少93.2%，83.6%，89.2%。在这三个shRNA干扰质粒中，相比于p2.1-N144和p2.1-N218干扰质粒，p2.1-N71表现出更好的抑制效果。另外，我们在线BLAST分析N基因的同源性，发现至少有32株PRRSV与JL07SW株N基因同源性为100%，并且这32株PRRSV均属于美洲型，因此我们推测，N71是高效抑制美洲型PRRSV复制的RNAi靶点。另外，我们应用生物信息学软件DNAStar中Protein模块，对GP5蛋白的二级结构进行预测，预测结果显示，GP5蛋白属于β折叠为主的蛋白，并对其亲水性、两性区、柔韧性以及表面可及性进行分析，选择抗原指数高，亲水性强，表面可及性为正值，并且除去α-螺旋、β-折叠、信号肽和跨膜区的区域，最终筛选出GP5蛋白潜在的优势中和表位区可能是30-41位、49-57位、130-142位、146-156位、159-175位、以及191-199位氨基酸，与理论结果相符。根据预测结果并结合文献报道，我们将GP5基因上27-31位氨基酸缺失，并在缺失位点连入37-45位氨基酸，通过重叠PCR方法扩增缺失A表位及缺失A表位后串联B表位的重组GP5基因（△aGP5及bGP5）。并将改造后的GP5基因连入重组腺病毒穿梭载体pShuttle中，构建重组pShuttle穿梭质粒，分别命名为pShuttle-△aGP5，pShuttle-bGP5，以及pShuttle-GP5，同时构建未带外源基因的空穿梭质粒，作为阴性对照，命名为pShuttle-K。将四种pShuttle穿梭质粒和腺病毒骨架质粒pacAd5，用限制性内切酶PacⅠ线性化后，共转染HEK293AD细胞，在HEK293AD细胞中正确包装出四种重组腺病毒，分别为AD-△aGP5，AD-GP5，AD-bGP5以及AD-K。通过对重组腺病毒稳定性，Western blot免疫印迹及间接免疫荧光检测。结果显示，正确包装出了重组腺病毒，F6代时重组腺病毒的稳定性仍然较好，表达的蛋白大小约为25KD，与预期结果相符。将靶向N基因抑制PRRSV复制效果好的p2.1-N71干扰质粒及包装的重组腺病毒AD-△aGP5，AD-GP5，AD-bGP5，以及AD-K分别免疫15日龄仔猪，一免两周后加强免疫一次，二免一周后鼻内接种PRRSV JL07SW株（TCID50为106.2ml-1）1mL/头，进行动物免疫试验，检测其诱导产生的体液免疫和细胞免疫水平，并与商品化弱毒疫苗JXA1-R所产生的免疫效果相比较，初步研究将N基因及GP5基因作为免疫原性基因构建病毒活载体疫苗的免疫效果，研究缺失ADE表位后GP5基因的免疫抑制情况。对免疫后0、7、14、21、28、35、42和56d的疫苗接种组和对照组免疫的仔猪血清进行无菌采集。分别应用间接ELISA方法进行特异性抗体检测，应用固定病毒稀释血清法检测特异性中和抗体，并提取病毒总RNA作为模板进行实时荧光定量PCR，检测仔猪血清中病毒滴度。结果均显示，除阴性对照组外，在各个试验组中，干扰质粒p2.1-N71组所产生的抗体水平低于其他修饰型重组腺病毒试验组，但能够在攻毒后7d抑制PRRSV的复制。各试验组与野生型重组腺病毒AD-K组比较，整个试验过程中，仔猪体内所诱导的抗体水平显著高于野生型重组腺病毒AD-K对照组，差异极显著（P<0.01）。而免疫PRRSV弱毒活疫苗JXA1-R组所产生的抗体明显高于修饰型重组腺病毒组，差异显著（P<0.05），攻毒7d后，病毒明显受到抑制，并持续至21d。三个修饰型重组腺病毒免疫组相比较，AD-bGP5免疫组诱导产生的抗体水平略高于其他免疫组，但差异不显著（P＞0.05）。T淋巴细胞亚群数量检测结果表明，各修饰型重组腺病毒试验组能够明显提高T淋巴细胞亚类数量，增强细胞免疫反应。综上所述，N基因和GP5基因在仔猪体内能够产生特异性抗体，诱导机体产生良好的体液免疫和细胞免疫反应，有效抑制PRRSV的感染，可能是引起ADE效应的结构基因。本研究为防控PRRSV感染和PRRS疫苗研制提供了理论基础和实验数据。