世界卫生组织明确将肥胖列为疾病的一种。肥胖可引发糖尿病、高血压、心功能受损、癌症等多种疾病,且对人类造成的威胁日益剧增,严重威胁着各个年龄段肥胖人群的健康。因此,对肥胖产生机制和治疗研究成为科研领域迫切渴望解决的难题。药物靶标是药物研发重中之重,为疾病治疗提供新途径,为药物筛选提供新突破口。近年来,科学领域不断发展,随之也产生了一些新兴的药物靶标找寻技术,给肥胖症患者带来了福音。本课题主要对连翘苷的减肥靶标进行了初步识别与验证。首先在细胞水平上对连翘苷的减肥作用进行了确认;其次运用网络药理学方法对连翘苷潜在减肥作用靶标进行预测;然后一方面用DARTS技术结合电泳实验找寻连翘苷靶标,另一方面用分子对接技术研究了连翘苷与PDE3B的相互作用;最后基于上述研究结果及文献调研推测连翘苷的减肥靶标可能为PDE3B,并分别从细胞水平与分子水平对其展开验证实验。主要研究内容和实验结果总结如下:1.连翘苷减肥作用确认。主要利用MTT法、荧光染色法进行研究。结果表明:当浓度为1-100μM时,连翘苷对HepG2细胞存活率无影响。用DMEM高糖培养基（30 mM D-glucose）孵育HepG2细胞,构建脂滴累积细胞模型,然后用不同浓度连翘苷孵育细胞,用尼罗红对HepG2肝细胞进行染色,发现HepG2细胞荧光强度随着连翘苷浓度（1.25、2.5、5μM）的增加有所减弱,当连翘苷浓度≥5μM时,HepG2细胞荧光强度基本保持不变。以上研究表明连翘苷能够抑制高糖诱导的HepG2肝细胞中脂滴的积累,即在细胞水平上连翘苷确实具有减肥作用。2.连翘苷潜在减肥作用靶标的虚拟筛选。采用网络药理学这一信息学手段进行靶标筛选。首先依据反向药效团匹配方法预测连翘苷靶点（成分靶点）,然后与GeneCards与CooLGeN数据库筛选得到的肥胖靶点（疾病靶点）比对分析,采用Cytoscape软件构建靶点相互作用网络图,采用ClueGO软件对靶点进行GO分类富集分析与KEGG通路分析。结果表明:网络药理学分析中共得到27个连翘苷潜在减肥作用靶点,其中PDE3B即是27个靶点之一。GO分类富集中,生物过程分析表明其主要参与调节纤维细胞增殖、胰液分泌、一氧化氮介导的信号转导、超氧化物代谢、I-κB激酶/NF-κB信号传导、维甲酸受体信号、脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、壳聚糖的分泌与运输等相关生物过程;分子功能分析表明相关靶点主要参与核受体活动,影响氧化还原酶活性,作为受体参与过氧化作用,与类视黄醇X受体结合等分子功能。KEGG通路分析表明,预测的靶点涉及小细胞肺癌通路与脂肪细胞脂解调控通路。3.连翘苷减肥作用靶标实验筛选。首先采用DARTS技术,结合SDS-PAGE电泳进行靶标识别,分别从链霉蛋白酶E的浓度、水解时长、水解温度等方面探索连翘苷的靶标蛋白,其次运用分子对接研究连翘苷与PDE3B相互作用。DARTS/SDS-PAGE结果显示:电泳条带中未能观察到明显的蛋白浓度差异条带,主要归因于DARTS技术较难找到低丰度靶蛋白,经文献调研并结合网络药理学预测结果,推测PDE3B可能为连翘苷潜在减肥作用靶标。分子对接结果表明,一方面连翘苷与PDE3B的Total-Score大于米力农（milrinone,PDE3抑制剂）,另一方面连翘苷与PDE3B之间有7个氢键形成,而米力农与PDE3B间无氢键形成。因此,连翘苷极有可能为PDE3B潜在抑制剂。4.连翘苷减肥作用靶标验证（PDE3B）。分别从细胞水平和分子水平展开验证。细胞水平上首先对连翘苷和米力农竞争同一靶标PDE3B进行实验验证,其次用ELISA试剂盒法对连翘苷是否能抑制靶标PDE3B,从而可提高cAMP含量进行验证;分子水平上合成PDE3B基因,构建pET-28a-PDE3B重组质粒,对PDE3B蛋白表达、复性、纯化和验证实验进行了初步探索。结果表明:细胞水平上,米力农抑制HepG2肝细胞中脂质的积累,并且连翘苷与米力农竞争同一活性位点;同时,连翘苷能够增加肝细胞中的cAMP含量。因此,连翘苷可能是PDE3B的潜在抑制剂,即PDE3B可能是连翘苷的减肥靶标。分子水平上,由于PDE3B中疏水氨基酸较多,在大肠杆菌原核表达系统中对重组质粒分别进行IPTG浓度、诱导温度以及Ca²⁺浓度等条件考察后,结果表明其主要以包涵体形式存在,由于PDE3B蛋白变性后复性较为困难,分子水平验证实验仍在进行中。