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背景：梗阻性肾积水是泌尿外科常见多发病,通过外科手术方法去除尿路梗阻是临床治疗肾积水的首选方法,但是由于长期慢性梗阻性导致肾脏纤维化,许多患者就诊时患侧肾脏功能已完全丧失而不得不行肾脏切除手术,因此寻找新的药物或方法延缓肾纤维化的过程对于肾积水等慢性肾病患者具有极其重要的治疗意义。肾积水诱导的肾纤维化是一个复杂的病理生理过程,大量的信号(通道)分子参与其中,目前尚没有特效药物能够减轻甚至逆转肾积水肾纤维化的发展。本研究小组前期通过基因芯片筛查发现Lefty基因在人重度肾积水组织中表达下降非常显著(↓13.55倍),而此蛋白的主要功能在于通过拮抗转化生长因子β1(TGF-β1)/Smads信号通路调节胚胎发育。鉴于TGF-β1/Smads通路在梗阻性肾积水肾纤维化中的核心作用,我们推测Lefty蛋白可能具有抗肾纤维化的功能。本研究拟构建pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体,并将其稳定转染肾小管上皮细胞(HK-2)细胞使细胞能够持续高表达LeftyA蛋白,以验证LeftyA对TGF-β1诱导HK-2细胞纤维化的作用及相应机制。目的：构建pcDNA3.1/Hygro(+)-LeftyA真核表达载体,并建立LeftyA稳定表达细胞系,探讨LeftyA蛋白对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的影响及其作用机制。方法：以LeftyA的全长序列pCMV-SPORT6为模板经PCR反应获得LeftyA编码区DNA,将其插入pcDNA3.1/Hygro(+)中构建LeftyA真核表达载体；通过LipofectamineTM 2000将此重组质粒转染入HK-2细胞,并通过潮霉素B(Hygromycin B)筛选挑取阳性表达克隆从而构建LeftyA稳定表达细胞系；Western blot及RT-PCR验证此稳定转染细胞系中LeftyA蛋白及mRNA基因的表达。用TGF-β1(10 ng/ml)刺激体外培养的HK-2细胞及高表达LeftyA蛋白的稳定转染细胞系,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,Western blot、RT-PCR分别检测E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)及LeftyA表达的变化,通过Real-time PCR检测Ⅰ型胶原蛋白(Col I)基因表达变化,从而观察LeftyA蛋白对TGF-β1所致EMT的影响。并于不同时间点分别通过Western blot及Real-time PCR检测细胞中p-Smad2/3蛋白、胞浆胞核中Smad2/3蛋白及结缔组织生长因子(CTGF)、Col ImRNA基因表达的变化,以研究LeftyA蛋白对TGF-β1/Smads信号通路及CTGF表达的影响。结果：PCR成功扩增出LeftyA编码区DNA目的片段,通过酶切及连接反应将其插入pcDNA3.1/Hygro(+)真核表达载体中；酶切、琼脂糖电泳及基因测序结果均证实pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体构建成功；Hygromycin B成功筛选出稳定转染pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体的细胞克隆,经传代培养后得到高表达LeftyA蛋白的HK-2细胞系；Western blot及RT-PCR结果证实此细胞系高表达LeftyA蛋白及mRNA基因。TGF-β1(10ng/ml)刺激体外培养的HK-2细胞及高表达LeftyA蛋白的稳定转染细胞系,光镜结果显示TGF-β1可诱导HK-2细胞变形拉长呈长梭形外观,随着作用时间的延长细胞变形不断加重,而上调LeftyA蛋白表达可明显抑制这种形态改变。RT-PCR、Western blot结果示, TGF-β1刺激后HK-2细胞内E-cadherin mRNA和蛋白时间依赖性表达下调,Col I mRNA及a-SMA mRNA和蛋白时间依赖性表达上调,同时E-cadherin表达变化早于a-SMA; LeftyA蛋白表达水平呈时间依赖性下调,刺激12 h后即检测不到其表达；上调表达LeftyA蛋白可以显著抑制TGF-β1诱导HK-2细胞内E-cadherin的下调表达(P<0.05),并逆转a-SMA及Col I的上调表达(P＜0.05)另一方面,正常HK-2细胞内没有p-Smad2/3的表达,TGF-β1刺激30 min即可诱导其激活表达,并在1 h时迅速达到高峰,其后开始下降；同时ICC结果显示TGF-β1刺激后胞浆及胞核均可见p-Smad2/3的表达；而基础状态下HK-2细胞浆及胞核中均可见Smad2/3的表达,且以胞浆表达较强,经TGF-β1刺激1 h后胞核内Smad2/3的表达明显强于细胞浆；TGF-β1刺激24 h后CTGF及ColⅠmRNA基因时间依赖性表达上调。而上调LeftyA蛋白表达能够抑制TGF-β1对p-Smad2/3的激活及Smad2/3向细胞核内的移位；同时LeftyA能够抑制TGF-β1/Smads信号通路下游效应分子CTGF的转录增加,并减少Col I的表达。结论：pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体及稳定表达LeftyA蛋白的HK-2细胞系构建成功,LeftyA蛋白能够抑制TGF-β1诱导HK-2细胞向成纤维细胞的转分化,而这种抑制作用与其对TGF-β1/Smads信号通路及CTGF表达的抑制直接相关。