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目的:原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)发病率占全球肿瘤性疾病的第五位,死亡率高居第三位。在发展中国家,慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是造成肝硬化,进一步发展成肝癌的最主要原因。许多病毒相关因素包括体内病毒高复制水平,HBV基因型C DNA感染以及HBV核心启动子区(basal core promoter region,BCP)突变都是引起HCC的重要原因。HBV DNA是一种大小约为3.2Kb的部分双链环状DNA,它属于正嗜肝病毒属科。HBx基因编码由154个氨基酸组成的大小为17 kDa的HBx蛋白。HBx具有很强的反式激活功能,它可以激活下游一系列信号通路包括NFAT、CREB/ATF、Wnt/β-catenin和NF-κB,进而具有促肿瘤形成的作用。A1762T/T1764A(简称TA突变)发生在HBx基因与核心启动子重叠的BCP区,它常见于慢性肝炎和HCC患者,其在HCC患者的发生率明显高于慢性肝炎患者。动物体内实验证实TA突变能够明显增强HBV复制,抑制血清中HBeAg表达水平。此外,TA突变还可以作为一种判断肝癌患者手术后预后的重要指标。发生在BCP区的T1753A/A1762T/G1764A/T1768A突变(简称Combo突变)或其它多点联合突变包括g1613a,c1653t,t1753v,a1762t,g1764a突变被发现与hcc发生有密切的联系。大量体外功能学实验发现hbx对肝癌细胞的生长具有一定的抑制作用,t1753a/a1762t/g1764a/t1768a突变能够使hbx蛋白发生i127n/k130m/v131i/f132y氨基酸改变,可以明显促进肝癌细胞的增殖。然而hbxcombo突变促进肝癌细胞增殖和hcc发生的机制至今尚不明确。wnt/β-catenin异常活化参与多种肿瘤的发生,包括乳腺癌、结肠癌、卵巢癌等。经典的wnt/β-catenin信号通路组成包括wnt家族分泌蛋白、frizzled家族跨膜受体蛋白dishevelled(dsh)、apc、axin、gsk3β、β-catenin及tcf/lef家族转录调节因子。ctnnb1(β-catenin)、axin2、apc基因突变可以引起wnt信号通路异常活化进一步导致hcc。hbx能够通过与wnt1相互作用或者激活erk激酶提高胞质内β-catenin水平,但hbx突变是否能进一步激活wnt/β-catenin信号通路尚未报道。因此本课题主要研究hbxcombo突变促进肝癌细胞增殖和侵袭的相关机制,并且在hbv相关肝癌及癌旁组织中观察hbxcombo突变对β-catenin定位及表达影响。方法:我们利用重组腺病毒的方法构建不同的hbx突变体,包括a1762t(t突变),g1764a(a突变),a1762t/g1764a(ta突变)和t1753a/a1762t/g1764a/t1768a(combo突变),构建成功的hbx突变腺病毒都能够有效地感染肝癌细胞。我们用mts和transwell小室实验观察hbx突变对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响,采用启动子活性报告实验和免疫荧光观察hbx突变对wnt/β-catenin信号通路的活化情况,qrt-pcr和westernblot检测hbx突变对wnt信号通路下游靶分子的影响。此外,我们采用免疫组织化学染色方法观察hbv相关肝癌组织中hbx突变对肝癌和癌旁标本中β-catenin表达和定位的影响。结果:与野生型hbx相比,hbxta突变和combo突变能明显促进肝癌细胞的增殖和迁移能力(p<0.01)。wnt信号通路拮抗剂sibc能明显减弱ta及combo突变对肝癌细胞的促增殖和迁移能力(p<0.01)。启动子活性报告实验发现与gfp对照组相比较hbxwt组top-luc活性是对照组的3.50±0.25倍,hbxta和combo突变组启动子活性分别是hbxwt组的1.97±0.10和2.25±0.09倍(p<0.01)。免疫荧光实验证实hbxta和combo突变能进一步增强细胞内β-catenin表达,促进β-catenin胞核转位。此外,我们发现hbxcombo突变能够使细胞内β-catenin的主要降解诱导物gsk-3β磷酸化水平增强,gsk-3β活性下降,进一步促使β-catenin在胞浆内积聚,并转位入核。wnt/β-catenin信号通路活化进一步导致下游靶基因c-myc,ctgf和wisp2表达增加。我们进一步通过巢式pcr方法了解肝癌和癌旁组织中bcp区发生突变情况,实验发现ta突变在hbv相关肝癌中最为常见,其中肝癌组织ta突变率占40%,癌旁组织占38%。而combo突变在肝癌组织占2%,癌旁组织比例为4%。统计学分析发现ta突变和combo突变在肝癌组织和癌旁组织分布并没有明显统计学差别(p>0.05)。免疫组织化学染色结果提示HBx TA和Combo突变能增强肝组织内β-catenin表达,并且可以引起β-catenin发生部分核转位。结论:HBx TA突变和Combo突变能够明显促进肝癌细胞的增殖及侵袭能力,阻断Wnt信号通路后能明显减弱TA和Combo的促增殖和侵袭作用。HBx Combo突变能使细胞内GSK-3β磷酸化水平增强,进一步引起胞质内β-catenin积聚,发生胞核转位。在HBV相关肝癌组织中发现Combo突变能增强β-catenin表达和促进其核转位,参与HCC的发生。了解HBx突变致病机制对于临床预防和治疗HCC有着较强的理论和现实意义。