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拟南芥(Arabidopsis thaliana.)是植物研究的模式生物,具有生长速度快,繁殖周期短,植物器官完善、生长表型多样化等特点,是理想的植物研究材料。细胞色素f (cytochrome f, Cyt f)是植物细胞叶绿体中电子传递链的重要组成部分,其通过自身C端跨膜区锚定于叶绿体类囊体膜上,N端则游离于类囊体基质中。相关文献报道,叶绿体可以诱导拟南芥悬浮细胞发生PCD; Cyt b6f复合物具有过氧化物酶活性,可以加快植物细胞过敏性死亡反应。植物细胞程序性死亡是近些年研究的热点,研究进展较快。植物PCD贯穿于整个植物的生命周期,涉及到植物种子萌发、组织器官发育和分化、植物抗病免疫防御、植物胁迫应激反应等。与动物细胞凋亡相比,植物细胞PCD在细胞形态上特征表现略有不同,如无细胞凋亡小体的产生,植物细胞液泡参与PCD,液泡膜融合,液泡内部PH下降等。拟南芥Cyt f全长320个氨基酸,C端18-20个氨基酸残基组成一个跨膜结构域。本实验以野生型拟南芥为研究材料,以野生型拟南芥叶片cDNA为模版通过PCR扩增方法扩增得到细胞色素f的编码基因AtPetA,通过引物设计去除AtPetA编码的C端跨膜区的片段,最终扩增得到的核酸片段为861bp。将该片段插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,成功构建AtPetA对pGBKT7-AtPetA进行毒性检测和自激活鉴定发现,该诱饵载体在酵母中的表达产物BD-AtCyt f对酵母Y2H Gold无毒性作用,且无法激活转录酵母中HIS3, ADE2, MEL1 和 AUR1-C报告基因。因此,将该重组诱饵载体用于拟南芥cDNA文库的筛选,最初用SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基筛选得到了39个阳性克隆,将39个阳性克隆在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal/AbA平板进行多次划线生长,最终得到6个阳性克隆c-4、c-9、c-24、c-25、c-27、c-32。对该6个阳性克隆进行prey载体抽提并送去测序,最终发现5个候选互作蛋白：含P环的三磷酸核苷水解酶(P-loop containing nucleoside triphosphate hydrolases, AtP-NTPase)、26S蛋白酶体组成亚基(26S proteasome subunit, AtRPN9b)、E3-泛素连接酶(E3-ubiquitin ligase, AtATL72)、核因子Y的β亚基(Nuclear factor Y β subunit, AtNF-YB13)、钙依赖性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase, AtCDPK32)。通过相关文献检索发现,这5个候选互作蛋白均与植物PCD相关,不同程度的参与调控植物PCD的发生。为了验证该5个候选互作蛋白与AtCyt f的相互作用,将抽提的重组prey质粒分别与pGBKT7-AtPetA共转酵母Y2H Gold。观察共转酵母在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/AbA平板上的生长情况发现,AtCytf 与 AtATL72相互作用最强；与AtP-NTPase、AtNF-YB13相互作用则相对较弱；与AtRPN9b、AtCDPK32则没有相互作用。综合文库筛选与回转验证结果,我们可以得出结论：AtCyt f 与 AtATL72之间存在相互作用且作用强烈,与AtP-NTPase、AtNF-YB13相互作用较弱,AtATL72可能是AtCyt f在PCD中的相互作用蛋白。以上实验结果说明,拟南芥E3-泛素连接酶AtATL72是AtCytf的相互作用蛋白。由于用于酵母双杂交的AtCyt f缺少跨膜结构域,因此可以推测,AtATL72与AtCyt f的相互作用可能发生在植物细胞细胞质中,那么该相互作用可能发生在AtCyt f从叶绿体释放出之后。