论文部分内容阅读
目的:子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在我国有逐渐上升的趋势,且趋于年轻化,严重危害女性健康。子宫内膜癌的发生、发展与很多因素有关,如长期雌激素刺激同时无孕激素拮抗、抑癌基因失活等机制。本课题前期研究发现,TAM具有刺激子宫内膜细胞雌激素受体(estrogen receptor,ER)作用,即具有雌激素受体激动剂作用,可导致子宫内膜病变,甚至发生子宫内膜癌[1],而且TAM或雌激素(E2)处理高中低分化的三种子宫内膜癌细胞后ARID1A表达均明显低于其在未处理子宫内膜癌中的表达,并且细胞周期均表现为G0/G1期缩短,S期延长。ARID1A(AT-rich interacting domain containing protein,又称脑蛋白120、SMARCF1、p270等)是染色质重组复合物之一,是新发现的肿瘤抑制基因之一,其低表达与多种肿瘤发生相关。研究发现ARID1A在低分化子宫细胞癌及透明细胞癌中表达明显降低。Zeng等[2]发现,在胶质瘤细胞中ARID1A过表达会下调p-Akt及p S6K,这提示ARID1A可能通过PI3K-Akt通路调节细胞增殖。在卵巢透明细胞癌中,ARID1A缺失与PIK3CA突变呈正相关[3]。在子宫内膜癌中ARID1A低表达和PI3K途径的突变和激活有关[4]。ARID1A可能与PI3K途径存在相互作用,影响Akt的磷酸化水平,从而控制肿瘤细胞的增殖[5]。本课题的前期实验研究证明,在子宫内膜癌细胞中ARID1A基因与ER基因的表达呈正相关[6]。PI3K/Akt信号通路(磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶,phosphatidylinositol-3-kinases/protein-serine-threonine kinase)是细胞内重要信号转导通路之一,参与了细胞增殖、凋亡及分化等功能的调控作用。近年研究表明,在许多肿瘤中发现PI3K/Akt通路活性异常,而其通路的活性紊乱不仅能导致细胞恶性转化,并与肿瘤细胞的迁移、黏附及肿瘤血管生成等密切相关。研究表明,雌激素可以通过结合ER,在一些共激活因子的共同作用下,激活子宫内膜癌细胞中PI3K/Akt信号通路,进而引起细胞发生相应改变[7,8]。ARID1A基因的缺失是经过何种信号通路导致子宫内膜癌的发生,目前国内外尚无研究。ARID1A与ER均通过PI3K/Akt通路发挥生物学作用,但是ARID1A基因与ER是否存在直接作用或是否经过PI3K/Akt通路相互影响尚不清楚。本实验研究旨在通过采用雌激素受体激活剂(TAM),或采用雌激素受体阻断剂(ICI182780)处理子宫内膜癌细胞株Ishikawa后,观察ARID1A与ER表达的变化,探究ARID1A基因在子宫内膜癌细胞发生、发展中的作用,以及ARID1A是否通过ER的改变来影响PI3K/Akt信号通路及可能的作用机制,从而为子宫内膜癌的分子生物学发病机制提供初步的理论依据。方法:1细胞培育:人子宫内膜癌细胞株Ishikawa,以10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养,培养于37℃,5%CO2、饱和湿度的培养箱内。以0.25%胰蛋白酶消化传代。细胞呈单层贴壁生长,选用对数生长期进行实验。2实时定量q RT-PCR法检测TAM、ICI182780依据不同浓度及不同时间处理子宫内膜癌细胞株Ishikawa后ARID1A、ERα、ERβ、PR、P53、PIK3CA、Aktm RNA的表达水平。3 Western-blot法检测TAM、ICI182780依据不同浓度及不同时间处理子宫内膜癌细胞株Ishikawa后BAF250a、ERα、ERβ、PR、P53、PIK3CA、p-Akt蛋白的表达水平。4流式细胞术测定TAM、ICI182780依据不同浓度及不同时间处理子宫内膜癌细胞株Ishikawa后细胞周期及凋亡变化情况。结果:1经过不同浓度TAM处理子宫内膜癌细胞株Ishikawa后,ARID1A、ERα、ERβm RNA及蛋白的表达随着药物浓度的增加而降低,随着药物处理时间的延长而降低(P<0.05),而PR、P53、PIK3CA、Aktm RNA及蛋白在子宫内膜癌细胞株Ishikawa中的表达随着药物浓度的增加而增加,随着药物处理时间的延长而增加(P<0.05),呈时间-剂量依赖性。经过不同浓度ICI182780处理子宫内膜癌细胞株Ishikawa后,ARID1A、ERα、ERβm RNA及蛋白的表达随着药物浓度的增加而增加,随着药物处理时间的延长而增加(P<0.05),而PR、P53、PIK3CA、Aktm RNA及蛋白在子宫内膜癌细胞株Ishikawa中的表达随着药物浓度的增加而降低,随着药物处理时间的延长而降低(P<0.05),呈时间-剂量依赖性。2经过不同浓度TAM处理子宫内膜癌细胞株Ishikawa后,细胞表现为随着药物浓度的增高及处理时间的延长,G0/G1期逐渐缩短,S期逐渐延长(P<0.05),凋亡率改变不明显。经过不同浓度ICI182780处理子宫内膜癌细胞株Ishikawa后,细胞表现为随着药物浓度的增高及处理时间的延长,凋亡率逐渐增加(P<0.05),细胞周期改变不明显。结论:ER激活或阻断后ARID1A的表达下调或上调,进而诱导了下游PI3K/Akt通路的变化,细胞周期也发生变化。子宫内膜癌的发生可能与ER激活,进而ARID1A功能受抑制和Akt的活化相关。