黄芪糖蛋白的分离纯化、结构分析及免疫活性的研究

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糖蛋白是一类由糖类与多肽或蛋白质以共价键相连接而形成的结合蛋白。研究表明,糖蛋白具有调节免疫、降低血糖、抑制肿瘤、抗氧化、防衰老、调血脂等作用。黄芪糖蛋白的研究对开发新药具有较大的应用价值,对提高人们的健康水平具有广阔的应用前景。本论文以黄芪为原料,对黄芪糖蛋白进行了分离、纯化,并系统的研究了黄芪糖蛋白的理化性质、组成、结构及免疫调节作用。为黄芪的开发利用提供理论指导和工艺参数。本文通过水浸提法,采用单因素试验确定了黄芪糖蛋白的最佳提取条件;研究了DEAE-FF柱层析对黄芪糖蛋白的纯化条件,采用Sephadex G-50柱层析对黄芪糖蛋白进一步纯化;用BSA法对黄芪糖蛋白进行含量测定,SDS-PAGE法进行纯度鉴定;研究了黄芪糖蛋白的理化性质,对黄芪糖蛋白中氨基酸及单糖组成进行了分析;分离提取小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞,以MTT法检测单一组分HQGP-1对这些免疫细胞转化的影响;通过动物实验,研究了HQGP-1对小鼠体重及免疫器官指数,血清溶血素抗体生成及迟发型超敏反应的影响。主要研究结论如下:1).最佳提取条件为提取缓冲液为TrisCl (25mM pH8.0)-NaCl (50mM),浸提温度为55℃,浸提时间为1h,液料比1:10,提取次数为1次。2).黄芪糖蛋白纯化时采用Buffer A和Buffer B作为DEAE-FF弱阴离子交换层析柱的洗脱剂梯度洗脱,初步分离出糖蛋白后,再用Buffer A作为Sephadex G-50的洗脱剂进行第二步纯化,分离出HQGP-1.用SDS-PAGE法鉴定其为电泳纯;MALDI TOF/TOF型质谱测定其分子量为16797Da;对HQGP-1进行了红外光谱扫描,其特征吸收峰再次表明该组分为一种糖蛋白;对HQGP-1进行紫外光谱扫描,确定其糖肽键类型为O-糖苷键;测定了HQGP-1的单糖组成,结果表明HQGP-1的单糖组成主要有葡萄糖和阿拉伯糖;氨基酸自动分析仪测定了HQGP-1的氨基酸组成,共含有16种氨基酸,其中谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、懒氨酸含量最高;氨基酸序列分析结果为ESGINLQGDATL,为抗真菌凝集素AMML。3). HQGP-1对小鼠脾淋巴细胞,腹腔巨噬细胞,以及ConA、LPS诱导的脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的转化都有抑制作用,最大抑制浓度为10μg/ml。4).体内试验,低、高剂量和对照组之间,体重没有统计学差异,故可认为低、高剂量组的该项试验结果为阳性,给药不会造成小鼠的毒性反应;低剂量胸腺指数与对照组存在显著差异,脾指数差异不显著(p>0.05);高剂量脾指数、胸腺指数与空白对照组差异极显著(p<0.05);低、高剂量与对照组相比,HCIgM吸光度差异极显著((p<0.01)。
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