原发性肝癌(Primary Hepatocellular Carcinoma, PHC)是最常见的恶性肿瘤之一发病具有隐匿性、症状不典型、早期诊断困难和五年生存率低的特点。每年全世界PHC新发病例约60多万,其中超过50%的PHC与乙肝病毒(Hepadds B Virus, HBV)感染有关；而我国是乙肝的高发地区,每年新发肝癌病例占全球新发病例的55%,且以中壮年男性高发。因此,PHC已不仅成为一个极其严重的国际公共卫生问题,也是危害我国人民健康最严重的恶性肿瘤之一。目前,PHC的确切病因和发病机制尚未完全研究清楚。按照肿瘤干学说的理论,肿瘤的形成发展不是由一群具有均质特性的细胞所产生,而是由肿瘤组织中很少的一部分富有广泛增殖和形成肿瘤能力的肿瘤干细胞引发,并且这群细胞具有逃逸免疫监视和免疫防御的能力,从而在临床放疗、化疗过程中不会被杀灭而保留下来。因此,相比目前采用的杀死肿瘤细胞或缩小肿块等一系列并不能彻底治愈肿瘤的治疗方法,肿瘤干细胞概念的提出为肿瘤的治疗带来了新的观点和希望。上皮细胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是一种上皮细胞跨膜糖蛋白,最早作为肿瘤相关抗原被发现,因其在各种类型疾病的肿瘤组织中高水平表达,引起了特别的关注。目前大量的实验证实EpCAM可以作为诊断和治疗肿瘤的标记蛋白,许多从原发性肝肿瘤组织中分离建系的人原发性肝癌细胞系中含有EpCAM的表达,并且这种表达的肿瘤细胞具有肿瘤干细胞的某些典型特性,尤其对肿瘤发生和发展具有决定性的作用,因此推测EpCAM是筛选肿瘤干细胞的潜在标志。所以本文选择EpCAM作为研究指标分析其在原发性肝癌形成中的意义。本实验研究主要包括两个部分。第一部分是将本教研室建立的肝癌细胞系P2-HCC与本教研室保存的肝癌细胞系HepG2和SMMC7721,进行比较EpCAM的表达水平与EpCAM+细胞表达量的差异。首先,通过RT-PCR的方法在RNA水平检测了肝癌细胞系P2-HCC细胞EpCAM基因的表达,发现其在P2-HCC细胞中为显著高水平表达。其次,FACS分析检测发现P2-HCC细胞中EpCAM+阳性细胞比例明显较高,比例高达80%左右。然后,采用细胞免疫化学的方法分析发现EpCAM蛋白同样在P2-HCC肝癌细胞系高表达,表达区域为细胞膜上。最后,对临床原发性肝癌标本通过FACS检测分析和RT-PCR检测分析了,从而在组织水平再次验证了EpCAM+细胞比例和EpCAM表达水平的差异,该结果提示EpCAM+细胞和EpCAM高表达的细胞与肿瘤发生和临床诊断之间存在相关性。第二部分实验主要是以EpCAM作为分选指标,分别从肝癌细胞系P2-HCC、HepG2和原发性肝癌手术后标本中通过磁珠分选获得了EpCAM+细胞,以及将分选后细胞进行了致瘤实验,证实P2-HCC和HepG2肝癌细胞系中的EpCAM+细胞的确能够在NOD/SCID (nonobese diabetic/severe combined immunodeficient)小鼠体内行成肿瘤,并且在NOD/SCID小鼠体内成瘤特性存在差异。根据目前的研究认为,肿瘤干细胞鉴定的“金标准”是通过异体移植后能够在受体中形成与原发肿瘤类型完全相同的肿瘤能力。以上实验结果进一步印证了EpCAM作为肝肿瘤干细胞潜在标志和作为肝癌恶性程度指标的可能性。通过对肝癌细胞系P2-HCC、HepG2中EpCAM的表达和原发性肝癌组织标本中EpCAM的表达与肿瘤发生相关性进行深入对比实验研究,结果表明：(1)本教研室建立的肝癌细胞系P2-HCC中的确含有80%左右的EpCAM+细胞,而且稳定高水平表达EpCAM基因；(2)通过研究肝癌细胞系P2-HCC与HepG2细胞在NOD/SCID小鼠体内成瘤能力的差异,首次提出了肿瘤干细胞的数量差异与NOD/SCID小鼠体内成瘤的能力具有相关性。通过磁珠分选P2-HCC与HepG2肝癌细胞的成瘤实验发现EpCAM基因的表达量和EpCAM+细胞比例决定着肿瘤发生的特性和肿瘤的大小。