背景间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）具有很强的自我更新和多向分化潜能,能分泌多种生物活性因子,并有免疫调节和营养支持作用。虽然MSCs的许多基本生物学问题尚待明了,研究者们对其用于细胞移植治疗和作为组织工程种子细胞的应用前景倍感兴趣。组织中MSCs的数量极少,无法满足应用所需细胞数。通过体外培养获得干性正常、功能良好的足量MSCs,不论对其基础研究或应用研究,无疑是需要解决的首要问题之一。然而,目前这一问题的解决面临极大的挑战,涉及诸多影响因素。体内和体外两方面研究的进展,使得干细胞培养体系的氧浓度成为人们关注的一个重要因素。其一,各种干细胞的组织微环境氧分压显著低于常规细胞培养体系（18%O₂）;其二,在常规氧分压培养条件下,MSC存在扩增效率低、DNA受损、易发生细胞衰老和凋亡等问题。近来的不少实验结果提示了低氧对MSC体外培养的有益作用,但是其体外扩增效果距离理想仍相差甚远。还有一些文献报道,低氧培养条件不利于MSC的体外生存和生长。低氧程度、低氧暴露时间和细胞来源不同,是目前对MSC培养效果存在差异和不尽人意的常见解释。在细胞和分子水平深入研究氧浓度对MSC的影响,阐明低氧培养对其的作用机制,应能为MSC体外培养达到令人满意的效果提供必要支撑。至今,大鼠骨髓MSC（rat bone mesenchymal stem cell,rBMSC）低氧培养的报道甚少,尚未见低氧培养条件下rBMSC转录组学研究的报道。目的本研究旨在证明低氧对rBMSC体外生存和生长具有显著效应的基础上,采用RNA-seq技术进行低氧培养条件下rBMSC的转录组研究,深入探究低氧影响rBMSC生物学行为的分子机制,并进行实验结果的生物信息学分析,为具体运用低氧培养技术达到MSC体外扩增的满意效果,提供细胞水平和分子水平的理论基础,也为阐明MSC对低氧产生反应和适应的生理和病理机制提供新的认识。方法1.采用全骨髓贴壁法培养原代rBMSC,经传代纯化培养后,通过显微观察、三谱系诱导分化实验以及四种表面分子标记（CD29、CD90、CD45、CD11b/c）检测,进行MSC的细胞鉴定。2.取P3代rBMSC,分为三个氧浓度组（1%、5%和18%O₂组）,进行5 d或7 d（生长曲线绘制）的体外培养,采用细胞计数、CCK-8技术、克隆形成实验检测细胞生长能力;用流式细胞术做细胞周期分析和细胞凋亡率检测;用丝氨酸磷酸化组蛋白H3（phospho-histone H3,PHH3）荧光免疫技术测定细胞分裂指数;用western-blotting检测HIF-1α和caspase-3的表达水平。3.将P3代rBMSC分为两个氧浓度组,即低氧组（1%O₂）和对照组（18%O₂）,培养5 d后,收集总RNA样本。经mRNA提取、cDNA文库构建、HiSeq测序等步骤后,建立rBMSC的转录组数据库。进行库检、比对参比基因组、基因表达水平和差异表达分析,筛选出差异表达基因。以差异表达基因为对象,进一步进行基因功能注释、信号通路富集分析及蛋白网络互作分析。4.根据RNA-seq分析的结果,筛选10个表达差异显著的基因进行RT-qPCR验证。按前述方法将P3代rBMSC分为1%和18%两个氧浓度组,培养5 d,收集总RNA,以β-actin为内参,检测各基因mRNA的相对丰度。结果1.细胞生长曲线、集落形成和CCK-8实验显示,1%O₂组的rBMSC增殖能力显著高于18%O₂组;5%O₂组的rBMSC增殖能力也高于18%O₂组,但无统计学显著性。这些结果表明低氧培养对rBMSC具有促增殖作用,且呈现氧浓度依赖性。与18%O₂组及5%O₂组相比,1%O₂组的分裂指数（PHH3阳性细胞率）和增殖指数（S+G2/M期细胞的比例）均显著增高。1%O₂组的细胞凋亡率显著低于18%O₂组及5%O₂组,5%O₂组的细胞凋亡率也显著低于18%O₂组。Western-blotting显示,1%O₂组的caspase 3水平显著低于18%O₂组和5%O₂组,5%O₂组的caspase 3表达水平也显著低于18%O₂组;而与18%O₂组相比,1%O₂组和5%O₂组的HIF-1α表达水平均显著上调。2.RNA-seq测序数据质量评估结果表明,每个样本的clean bases量达7 Gb左右,碱基分布比较均匀,整体测序数据质量达到分析要求。所得的数据与参比基因组比对显示,各样本定位率均>81%,外显子reads数占比均>93%。3.基因差异表达分析显示,在低氧组与对照组之间,818个基因的表达量呈现差异显著性（q-value<0.05和log₂（Fold change）>2）,其中上调基因为541个,下调基因为277个。本研究首次发现低氧培养引起MSC中Mmp-7、Mmp-9、Mt1、Mt2A及Ptgs2基因表达水平的显著变化。4.差异基因GO富集分析显示,低氧组与对照组之间差异表达基因显著富集的GO terms数量达在735条（q-value<0.001）,这些基因的功能主要涉及细胞发育、生物调控、蛋白结合功能、刺激反应、代谢途径、细胞分化、细胞外区域和质膜组分表达、解剖结构形态发生。KEGG分析结果显示,低氧培养对rBMSC的影响与HIF-1信号通路、钙信号通路、趋化因子信号通路、细胞因子-受体互作、癌症相关性转录失调、异噬作用、代谢途径、PI3K-Akt信号通路、矿物吸收、Ras信号通路的相关度高。5.差异基因蛋白互作网络分析显示,Vegfa、Prkcb、Pik3r3、Ptgs2、Nme3、Gnaz、Adcy8、Nrp1、Gucy1b3、Itgb7及Aldh1a2等基因编码的蛋白处于蛋白互作网络中较为核心的位置,这些蛋白主要与细胞凋亡、HIF-1通路、PI3K-Akt信号通路、cGMP-PKG信号通路相关。6.RT-qPCR实验表明,与对照组比,低氧组Vegfa、Itgb7、Ptgs2、Mt1、Mt2A、Mmp7和Mmp9的表达显著上调（p<0.05）,而Il1rl1、Nrp1和Ogn的表达显著下调（p<0.05）,与RNA-seq检测结果相符。这些基因与抗凋亡、促增殖、促血管生成相关。结论1.在本研究的细胞培养实验条件下,低氧对rBMSC具有促增殖作用,并呈现氧浓度依赖性,其作用机制包括促细胞分裂和抗细胞凋亡。2.1%氧浓度体外培养可对rBMSC的转录组产生显著影响,显著差异表达基因的功能与细胞的生存、生长、分化、功能及调控作用相关,其中HIF-1通路下游抗凋亡和促增殖相关基因表达水平的变化,可能对低氧培养条件下rBMSC生存和生长的有益效应起重要作用。3.首次报道rBMSC中Mmp-7、Mmp-9、Mt1、Mt2A及Ptgs2五个基因的表达水平受低氧培养的显著影响,它们可能通过参与HIF-1通路或VEGF通路,发挥低氧条件下抗凋亡、促增殖以及促血管生成的作用。