研究背景:视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cell,RGC）,是视网膜中唯一的输出神经元,对视觉形成至关重要。外界光信号经视网膜感光细胞、双极细胞到达RGC形成神经冲动,并随RGC轴突继续向后传导至大脑形成视觉。RGC死亡与其轴突损伤与多种眼科疾病密切相关,主要包括青光眼、外伤性视神经病变、缺血性视神经病变、遗传性视神经病变与压迫性视神经病变。在成年脊椎动物中,RGC及其轴突很难再生,因此,当RGC及其轴突因疾病或外伤受损时,可以造成患者永久性视力下降,甚至失明。如何有效地治疗这些以RGC及其轴突损伤为主的视神经病变仍是全世界眼科领域攻关的热点与难点。目前,经典的视神经保护策略主要旨在通过调节RGC内不同分子信号机制,以延缓或阻断RGC程序性死亡。这些治疗策略主要包括两方面:其一是外源性应用具有神经保护作用的小分子化合物,其二是内源性调控RGC内与细胞死亡相关的基因表达。然而,这些以挽救RGC为核心的治疗策略仍无法逆转大量RGC死亡时导致的视觉功能障碍。为此,学者们将研究重点转向了如何促进RGC再生。经过十几年的摸索,RGC的细胞替代疗法以及体内直接重编程技术取得了重大进展。这些方法可以使胚胎干细胞、诱导多能干细胞,甚至是体细胞转分化为RGC以行使视觉传导功能。然而,通过这些技术获得的RGC再生效率较低,且在临床应用上面临着诸多难题。更重要的是,随着对RGC与其轴突损伤病理机制的深入理解,越来越多的研究表明单纯的RGC保护或再生并不能阻止大多数视神经病变中RGC因其轴突损伤而死亡的最终命运,无法有效促进已经损伤的轴突行使神经传导功能。因此,促进受损RGC轴突再生或者维系RGC轴突存活对于实现RGC最终神经保护十分关键。虽然通过调控RGC内特定基因可以促进长距离轴突再生,但基因编辑技术的临床应用面临许多困难,寻求一种更为高效、安全的轴突再生策略仍为视神经再生领域研究的焦点问题。以往的研究表明,星形孢菌素（Staurosporine,STS）作为一种广谱的蛋白激酶C抑制剂,可以促进多种细胞中轴突生长。因此,本研究以视网膜神经节前体神经元661W细胞与非神经元类ARPE-19细胞为研究对象,探究STS对视网膜中两种不同类型细胞轴突样结构生长的促进作用,通过转录组测序分析两种细胞中共同的差异基因变化,筛选与轴突生长有关的分子靶点,并通过体内实验进一步探讨所选出的分子靶点对RGC损伤的轴突再生作用。目的:1.通过STS细胞诱导实验,探讨STS对神经元类661W细胞与非神经元类ARPE-19细胞中轴突样结构生长的促进作用。2.通过转录组测序技术检测STS诱导下两种不同类型细胞的差异基因变化,分析两种细胞中出现共同改变的差异基因,探寻与轴突生长有关的分子靶点。并通过体外661W细胞诱导实验,初步验证所选出的分子靶点对神经元轴突生长的影响。3.通过体内视神经挤压（Optic nerve crush,ONC）模型,进一步探讨所选出的分子靶点对RGC轴突的再生作用。4.通过体内与ONC损伤机制不同的视网膜N-甲基-d-天冬氨酸（N-methylD-aspartate,NMDA）兴奋性毒性损伤模型,验证所选出的分子靶点对RGC及其轴突投射的维持作用。5.探究所选出的分子靶点发挥轴突再生与神经保护作用的潜在分子机制。方法:1.检测STS对661W细胞与ARPE-19细胞轴突样结构生长的促进作用通过光镜下形态学观察检测STS诱导661W细胞轴突样结构生长的现象,通过细胞免疫荧光染色与Western Blot检测STS诱导下661W细胞中神经元特异性轴突标志物β-III Tubulin、树突标志物MAP2与胞体标志物Neu N的表达变化。通过光镜下形态学观察与β-III Tubulin免疫荧光染色评估STS诱导ARPE-19细胞轴突样结构生长的作用。2.通过转录组测序技术与体外661W细胞诱导实验初步探寻与神经轴突生长有关的分子靶点通过对相同STS诱导条件下的661W与ARPE-19细胞进行转录组测序（RNA-Seq）,分析两种细胞中共同上调与共同下调的差异基因,结合对已发表文献的信息学分析,推选出可能与轴突生长密切相关的分子靶点,并采用q PCR检测对RNA-Seq结果加以验证。通过光镜下形态学观察与β-III Tubulin免疫荧光染色初步评估候选分子的重组蛋白外源性诱导661W细胞轴突样结构生长的作用。3.探讨所选出的分子靶点对ONC损伤中RGC轴突的再生作用通过霍乱毒素β亚基（Cholera toxin B subunit,CTB）对轴突特异性示踪检测给药组在ONC挤压点后的轴突再生现象。并使用轴突再生特异性标志物生长相关蛋白43（Growth-associated protein 43,GAP43）对视神经进行免疫荧光染色,确认轴突再生现象。同时设立不同时间段的ONC损伤组,评估RGC轴突随时间延长轴突再生增加的现象,多重验证再生轴突的生长。4.探究所选出的分子靶点对NMDA损伤中RGC存活的促进作用与RGC轴突投射的维持作用通过视网膜铺片的RGC特异性标志物多重剪接的RNA结合蛋白（RNA binding protein with multiple splicing,RBPMS）免疫荧光染色检测所选出的分子靶点对NMDA损伤中RGC存活的影响。采用CTB顺行轴突示踪与视神经横截面切片的β-III Tubulin免疫荧光染色方法检测所选出的分子靶点对NMDA损伤下RGC轴突与其至丘脑的远距离投射的维持作用。5.探讨所选出的分子靶点发挥轴突再生与神经保护的潜在作用机制通过Western Blot检测一些经典轴突再生与神经保护通路的活化状态,探究可能参与所选出的分子靶点发挥轴突再生、神经保护作用的分子机制。结果:1.STS可以诱导661W细胞发生显著分化,细胞形态发生明显改变,细胞胞体缩小、轴突样与树突样结构明显增多增长。免疫荧光染色与Western Blot中均检测到STS诱导下661W细胞内β-III Tubulin、MAP2与Neu N的表达水平显著提高。在同一作用条件下,STS诱导ARPE-19细胞出现的形态变化与661W细胞的分化形态极为相似。β-III Tubulin免疫荧光染色检测显示,在STS诱导下的ARPE-19细胞中存在许多较长的染色阳性的轴突样结构。2.RNA-Seq分析发现,CXCL2基因在STS诱导下661W细胞与ARPE-19细胞共同表达的差异基因中上调最为显著。q PCR检测显示,与载体对照组相比,STS诱导组661W细胞与ARPE-19细胞中的CXCL2基因表达水平均显著提高。与载体对照组相比,外源性CXCL2重组蛋白（Recombinant C-XC motif chemokine ligand 2,r CXCL2）可以诱导661W细胞的轴突样结构增多、变长,β-III Tubulin免疫荧光染色呈阳性,与STS诱导下661W细胞出现的形态变化相似。3.在ONC损伤中,与载体对照组相比,r CXCL2可以促进RGC轴突的再生,在CTB示踪与GAP43免疫荧光染色中均可以观测到视神经挤压点后RGC轴突的再生现象,并且14天给药三次组的新生轴突比7天给药两次组的轴突再生距离更长、数量更多。r CXCL2给药组中RBPMS阳性RGC的数量也显著增加,在ONC损伤14天时RGC存活率的提高尤为明显。4.在NMDA损伤中,与载体对照组相比,r CXCL2治疗组中RGC存活率显著提高,视神经、外侧膝状体与上丘中的CTB荧光强度均明显增加,视神经横截面β-III Tubulin免疫荧光染色阳性轴突数量也显著上升。5.组织学染色表明,小鼠RGC中存在CXCL2的特异性受体CXC趋化因子受体2（C-X-C motif chemokine receptor 2,CXCR2）。Western Blot显示,在r CXCL2治疗后,7天与14天ONC损伤的小鼠视网膜中与轴突再生有关的Janus激酶2（Janus kinase 2,JAK2）和信号转导和转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）蛋白的磷酸化水平显著增加。然而,NMDA损伤7天载体处理组与r CXCL2给药组之间的磷酸化JAK2和STAT3表达水平几乎没有变化,差异也不具有统计学意义。在ONC损伤7天小鼠中,与载体对照组相比,r CXCL2治疗组中促凋亡相关蛋白Bax与Cleaved Caspase-3表达水平没有明显降低,抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平虽有所上升但也不具有统计学差异。而在ONC损伤14天与NMDA损伤7天的小鼠中,可以观察到r CXCL2明显上调了Bcl-2表达,并显著降低了Bax与Cleaved Caspase-3的表达水平。结论:1.STS可以在体外诱导661W与ARPE-19两种视网膜细胞的轴突样结构生长;2.CXCL2基因与轴突生长有关;3.外源性r CXCL2可以在体外诱导661W细胞的轴突样结构生长;4.外源性r CXCL2可以促进体内ONC损伤中RGC轴突再生并提高RGC存活,也可以保护体内视网膜NMDA损伤中RGC并维持RGC轴突的长距离投射;5.外源性r CXCL2可以通过作用于CXCR2促进JAK2/STAT3信号通路激活介导轴突再生作用,并通过抑制Caspase-3凋亡途径发挥神经细胞保护作用。