论文部分内容阅读
随着菜用大豆[Glycine max (L.) Merr.]市场需求的增加,其栽培面积正逐年扩大。但土壤盐渍化的日益加剧及土壤缺磷,使菜用大豆的产量和品质受到了严重影响。如何提高菜用大豆的耐盐性及磷利用效率,以有效开发和利用我国盐渍及低磷土壤资源已经成为学者十分关注的话题。本研究采用农杆菌介导法分别将野生茄子(Solanum torvum Swartz) Na+/H+逆向转运蛋白基因(StNHXl)及水稻(Oryza sativa L.)磷转运蛋白基因(OsPT2)遗传转化菜用大豆,获得具有除草剂抗性的转基因植株,并采用营养液栽培法对转StNHXl基因菜用大豆T3代植株进行耐盐性分析及转OsPT2基因菜用大豆T2代植株进行磷高效利用鉴定。主要研究结果如下：1.从野生茄子耐盐砧木品种’Torvum Vigo’叶片中克隆出液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因StNHX1 ORF序列(GenBank登录号：JN606860.1)。序列分析表明,SNHX1基因ORF长1,599 bp,编码532个氨基酸,StNHX1基因序列与番茄NHX1基因序列相似性为93%。进化树分析显示,野生茄子StNHX1与番茄LeNHX1的亲缘关系最近,与海篷子SeNHX1亲缘关系最远。2.利用植物表达载体pCMBIA3301上的BamHI与SacI及SacI与XbaI酶切位点,分别将StNHX1、OsPT2基因定向插入植物表达载体pCMBIA3301中。成功构建以gus为报告基因、bar为选择标记基因的植物双元表达载体pCMBIA3301-StNHX1及pCMBIA3301-Ospt2。分别将表达载体转入农杆菌EHA105中,用于菜用大豆的遗传转化。3.野生茄子’Torvum Vigor’液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因StNHXl,通过农杆菌介导菜用大豆子叶节法遗传转化‘新辽鲜’,获得转基因植株。PCR及Southern杂交分析显示外源基因已整合至菜用大豆基因组中。Basta(?)涂抹叶片分析表明转基因植株具有除草剂抗性。GUS组织化学染色及半定量RT-PCR分析表明,外源基因可稳定遗传且StNHX1基因在T3代植株中超表达。超表达T3代植株用于耐盐性鉴定。盐胁迫下,转基因植株叶片的盐害指数、Na+及丙二醛(MDA)含量显著低于野生型对照(WT)植株,而K+/a+值、K+含量以及其它生理生化指标均显著高于WT植株。综上结果表明,超表达StNHX1的转基因菜用大豆具有较强的耐盐性。4.采用农杆菌介导法将水稻磷转运蛋白基因(OsPT2)遗传转化菜用大豆‘新辽鲜’子叶节,共获得10株转基因植株。Basta(?)涂抹叶片分析表明转基因植株具有除草剂抗性。半定量RT-PCR检测表明OsPT2基因在T2代植株中超表达。采用改良的Hoagland营养液栽培方法,对3个超表达OsPT2的T2代株系进行磷高效利用鉴定,结果显示：在低磷(20μMPi)及正常磷(1000 μM Pi)条件下,转基因植株的有效磷及总磷含量均显著高于野生型对照(WT)植株。在低磷胁迫下,转基因植株未出现缺磷症状,且生长势显著优于WT植株,种子产量也显著高于WT植株。试验表明,超表达OsPT2的转基因菜用大豆在低磷胁迫下表现出较高的磷利用效率。综上所述,转StNHXl基因菜用大豆具有较强的耐盐性、转OsPT2基因菜用大豆具有较强的磷吸收及利用效率；StNHX1及OsPT2可作为功能基因用于生物技术育种,在农业生产中可提高作物的耐盐性及对低磷土壤的适应性。