棉花是重要的纤维植物,在我国国民经济中占有非常重要的地位。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的一种维管束病害,严重影响棉花的产量与品质。由于没有有效的防治药物,黄萎病的防治很困难。且陆地棉中缺少抗病种质资源,抗病育种进展缓慢。生物防治被认为是最具有发展潜力的防治方法之一,在植物病害防治中具有非常好的应用前景,但棉花的生物防治尚没有明显进展。继续筛选抗黄萎病的生防菌,揭示其抗病机理,并筛选抗菌物质,以及进行抗黄萎病菌基因的克隆对于棉花黄萎病的防治、抗病育种等研究具有重要意义。本研究以棉花黄萎病菌V1070菌系为靶标菌,以具有不同黄萎病抗性的棉花品种为材料,选择性分离棉花植株内不同功能群体的内生细菌,研究品种抗病性与内生菌群体组成的关系。结果表明棉花品种的抗病性与内生菌群体的结构有密切关系。根据品种hi菌落的形态分离得到660株棉花内生菌,通过平板实验筛选,150株内生菌具有拮抗V1070的活性,被确定为拮抗菌。高比例的拮抗菌存在于抗黄萎病品种的根系中,抗病品种根系中的拮抗菌的比例显著高于感病品种,棉花品种对黄萎病的抗性可能与内生菌的种类和数量有关。通过ARDRA4分析,150个株菌被分为19个组,存在显著的遗传多样性。16SrRNA基因测序分析表明,拮抗菌中数量最多的是Pseudomonas(43.3%),其次是Bacillus (34.7%)和Enterobacter (10%).有些拮抗菌不仅含有拮抗物质,还能分泌促进植株生长的物质,存在代谢多样性。以上结果表明,棉花植株的抗病性与内生菌的群体结构和抗黄萎病菌活性有关,抗病品种可作为筛选抗黄萎病生防菌的材料。通过温室和田间试验,45株拮抗菌中有12株菌株对黄萎病具有良好的生防效果,都能降低棉花植株黄萎病的病指。有5株拮抗菌在田间的防效高于20%,能显著减少棉花的萎焉症状。这些菌株表现较好的生防效应,还能不同程度的提高植株的产量。综合分析盆栽和田间防治棉花黄萎病试验结果,菌株841P-3和41B-1菌株在田间都能极显著地降低棉花黄萎病的病情指数,而且防治效果较高,分别为22.79%和28.09%,因此是较好的防治棉花黄萎病的生防菌,有作为生物农药利用的潜力。另外我们发现Bacillus spp.拮抗菌的生防效应好于Pseudomonas spp..以上结果表明在体外具有抑菌活性的菌株在田间也能不同程度地提高棉花抗黄萎病能力和产量。在平板检测实验中,假单胞菌841P-3表现很强的抑菌活性,能使棉花黄萎病萎菌菌丝扭曲变形、膨大。电镜观察发现菌株841P-3能在棉花根部形成膜状结构,且大量定殖于棉花根系的表面和内部,可能通过竞争或在根系表面形成生物膜抵抗病原菌的侵染。根部接种和体外叶片接种实验表明,菌株841P-3能够减少根部和叶片病菌的生长、定殖和侵染。菌株841P-3还能够诱导棉花植株根系的木质素化,能诱导叶片胼胝质沉积、活性氧的爆发和诱导多种抗病相关物质的增加。菌株841P-3对棉花植株产生的防御反应能持续至少30天,通过二次接种,这些防御反应能被再次诱导。菌株841P-3能直接诱导棉花的防御反应,在感受到来源于病原菌的信号后,能启动更强的防御反应来应对病原的袭击。进一步研究了841P-3诱导抗性的机理,发现841P-3能诱导MAPK转录因子WRKY和棉花防御反应相关基因的表达。以棉花表皮细胞为研究材料,发现NO参与841P-3诱导棉花抗病性的提高,为棉花黄萎病的防治提供理论基础。在平板检测实验中,解淀粉芽孢杆菌41B-1表现出很强的抑菌活性,能使棉花黄萎病菌V1070的菌丝扭曲变形、膨大。菌株41B-1的发酵代谢液和甲醇提取物均能抑制V1070的生长。通过色谱质谱分析,抗真菌物质为脂肽类伊枯草菌素及其同系物。体外平板检测,菌株41B-1产生的伊枯草菌素能抑制V1070微菌核的生长,也能抑制V1070微菌核在土壤中的萌发,阻止其侵染棉花植株的根系,最终降低植株的萎焉症状。伊枯草菌素处理能诱导V1070细胞活性氧爆发,细胞肿胀(高渗透甘油反应)和细胞壁完整性缺失,最后导致细胞死亡和裂解。细胞死亡和裂解会产生PAMP而激发寄主的免疫反应。细胞壁组分在V1070抵抗伊枯草菌素中起重要作用。咯菌腈对伊枯草菌素诱导的黄萎病菌的敏感性具有促进作用,而百草枯对伊枯草菌素诱导的黄萎病菌的敏感性具有抑制作用。而且,除了直接的抑菌作用,伊枯草菌素处理棉花还能诱导植株防御反应和增加PAMP激发的免疫反应,同时减少棉花根部病菌孢子的定殖。基于以上发现,我们推断伊枯草菌素通过介导多种抗病途径提高棉花植株对V1070的抗病性。本研究筛选出大量的抗黄萎病菌的棉花内生菌,部分菌系在田间试验中对黄萎病有较好的防效,可以用于棉花黄萎病的生物防治。系统研究了假单胞菌841P-3和解淀粉芽孢杆菌41B-1两个菌系提高棉花对黄萎病抗性的机理,为黄萎病防治提供了新的技术途径,为棉花抗黄萎病种质资源创制提供了新的思路。