Mx蛋白在许多生物体内发现,具有广泛的抗病毒作用和GTP酶水解活性,是Ⅰ型干扰素诱导的蛋白,属于大分子GTP酶动态蛋白家族。该蛋白对多种负链RNA病毒有抑制作用。研究发现,不同物种及类型的Mx蛋白有不同的抗病毒特异性,并且其在抗病毒机理上也稍有不同。目前,对于该基因的表达、定位及其功能、作用机理的研究主要集中在人、小鼠等哺乳动物上,而对于家禽该基因的研究随着禽流感的爆发也日趋成为热点。本研究通过亚克隆鸡Mx基因,构建原核表达载体、真核表达载体,实现了该蛋白在不同体外条件下的表达及其抗体血清的制备,为鸡Mx蛋白的大量获取及其功能检测、作用机理研究奠定基础,同时也对家禽抗病基因的选择及抗病品种、转基因群体的制备提供重要的参考。主要研究结果如下:1.鸡抗病毒蛋Mx基因在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定。研究亚克隆鸡Mx基因cDNA序列,通过基因工程方法构建pET32a-Mx重组表达载体,并在工程菌Rossetta-gami (DE3)中诱导表达,并对诱导表达条件进行优化,以割胶纯化方法简捷获取纯化蛋白,Western blotting鉴定表达产物。研究结果显示:鸡Mx蛋白在37℃、0.8mmol/L IPTG浓度条件下诱导4小时时,在大肠杆菌中表达量最高。纯化和Western blotting鉴定结果显示,实现了鸡Mx蛋白在大肠杆菌中的融合、高效表达。2.鸡抗病毒蛋白Mx基因在毕赤酵母中的表达研究。研究将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的穿梭表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx。用电转化法转化毕赤酵母菌株GS115后,筛选出高拷贝重组子。阳性菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE检测。结果表明,成功构建了鸡抗病毒蛋白Mx基因穿梭表达载体,并筛选获得高拷贝菌株。表达产物经SDS-PAGE检测,结果显示,在甲醇浓度维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,并且外源基因表达蛋白约占上清蛋白总量的39.2%。3.鸡Mx基因组成型AAV-293细胞表达系的建立。本研究将鸡Mx基因克隆至pIRES2-EGFP载体,并引入6*His标签。鉴定正确后,将质粒pIRES2-EGFP-Mx转染AAV-293细胞,荧光倒置显微镜观察外源基因在细胞水平中的表达情况。并经RT-PCR,Western blotting等方法从RNA、蛋白质水平鉴定该蛋白在细胞中的表达。结果显示,目的基因实现了在AAV-293细胞中的表达,为稳定表达细胞系的建立奠定基础。4.基因免疫制备鸡Mx蛋白抗体血清的研究。采用基因免疫方法,将构建的真核表达载体pcDNA3.0-MMx用多聚乙酰亚胺(polyethylenimine,PEI)包裹后经肌肉途径免疫小鼠,连续免疫4次后,收集抗体血清,以间接免疫荧光(IFA)检测检测免疫血清抗体的效价,初步制备鸡Mx蛋白抗体血清。IFA结果显示:以1:50倍比稀释的血清能够特异性识别Mx蛋白;局部放大细胞IFA图片显示Mx蛋白呈颗粒状分布于细胞质中。