研究背景癌症是一种体内细胞生长失控的疾病。癌症多是以它开始的部位命名,即使后来扩散到身体的其他部位亦是如此。子宫颈在解剖学上连接阴道和子宫上部,开始于子宫颈的癌症称为子宫颈癌(Cervical Cancer,CC),又称为宫颈癌,所有女性都有患子宫颈癌的危险。研究表明,人类乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)感染是宫颈癌的主要危险因素。宫颈癌是由正常宫颈上皮细胞的异常生长导致的,进而侵袭或扩散到人体的其他部位。宫颈癌的病理变化过程是逐渐进展的,首先由正常的宫颈上皮到低级别鳞状上皮内病变(Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion,LSIL),再过渡到高级别鳞状上皮内病变(High-grade Squamous Intraepithelial Lesion,HSIL),最后进一步发展为浸润性宫颈癌。病理变化过程表明宫颈癌的发生发展与宫颈上皮细胞的异常增殖、迁移和侵袭能力有密切关系。因此明确宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力变化的具体作用机制,对宫颈癌的防治具有重要意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种长约22~25个核苷酸的的非编码RNA分子,广泛存在于动植物和一些病毒中,主要的功能是通过与靶基因结合调控靶蛋白的表达,从而参与RNA沉默和基因表达的转录后调控。其主要通过以下三个过程实现靶mRNA分子的沉默:(1)将mRNA链切割成两条;(2)通过缩短其poly(A)尾巴使mRNA失去稳定性;(3)降低核糖体将mRNA转化为蛋白质的效率。20世纪90年代初第一个miRNA才被发现,21世纪初miRNA才被学术界认定为是一种独特的生物调节因子,miRNA在植物和动物的发育以及许多其他生物过程中发挥着多重作用。miR-1266是近年来新发现的一个miRNA分子,在胃癌、前列腺癌等癌症中的表达水平均发生异常,这些研究结果提示其可能参与癌症的发生发展,但是在宫颈癌中的表达情况尚未见报道。同源物2(DAB2)相互作用蛋白(Disabled homologue 2-interacting protein,DAB2IP)是由DAB2IP基因编码产生的,全长约1036个氨基酸。DAB2IP是最近新发现的一种抑癌基因,与癌细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学行为过程密切相关。因此,本课题首先通过收集宫颈癌病人的宫颈癌组织和对照组病人的宫颈组织,并且收集上述宫颈癌病人血清,收集低级别鳞状上皮内病变病人、高级别鳞状上皮内病变病人和正常对照组病人的血清,明确宫颈癌组织和血清中miR-1266的表达水平;所有宫颈癌患者均接受50个月随访,以期分析miR-1266与宫颈癌病人生存预后的关系。其次,本课题使用Linked Omics网站从TCGA癌症数据中分析了与DAB2IP相关的miRNA,发现miR-1266在宫颈癌中与DAB2IP的关系密切,因此寻找miR-1266与DAB2IP的内在联系是本课题研究的另一个重点。最后,本课题采用体外宫颈癌细胞实验以期明确miR-1266对宫颈癌细胞的生存、增殖、迁移和侵袭功能的影响,采用宫颈癌裸鼠移植瘤动物模型体内实验以期明确miR-1266能否在体内促进宫颈癌的生长。通过这一系列试验,我们希望进一步揭示宫颈癌的发病机制,以为其防治思路提供理论支持。第一部分宫颈癌病人宫颈癌组织和血清中miR-1266的表达水平与其生存预后的关系研究目的1.检测宫颈癌病人宫颈癌组织和血清中miR-1266的表达水平;2.探讨miR-1266与宫颈癌病人生存预后的关系。方法1.宫颈组织标本的收集:病例组(CC):收集2013年10月至2017年12月在郑州大学第三附属医院未行术前系统治疗的宫颈切除术患者的宫颈癌组织50例;对照组(control group,CG):收集2013年10月至2017年12月在郑州大学第三附属医院因慢性宫颈炎行宫颈活检的患者的宫颈组织50例;2.血清标本的收集:收集上述宫颈癌组(CC)患者术前的血清标本50例,收集同期低级别鳞状上皮内病变组(LSIL)、高级别鳞状上皮内病变组(HSIL)和健康对照组(Healthy Control,HC)病人的血清标本各50例;3.所有宫颈癌患者均接受50个月随访,从手术日期到复发或死亡日期的间隔定义为随访期,最后一次随访是在2017年12月1日;4.采用实时荧光定量聚合酶链反应法(Quantitative reverse transcription polymerase reaction,q RT-PCR)检测宫颈组织和血清标本中miR-1266的表达水平;5.采用SPSS 21.0和Graph Pad Prism 5.0软件进行数据的统计和分析,所有数据计量资料均采用?x±s表示,数据行正态性检验。两组间数据比较采用独立样本t检验,多组间数据比较经检验方差齐性后采用方差分析。采用Kaplan Meier法对宫颈癌患者进行生存预后分析。以α=0.05作为检验水准。结果1.宫颈癌组和对照组宫颈组织中miR-1266的表达情况。宫颈癌组与对照组相比,miR-1266的表达水平是升高的,差异具有统计学意义(P<0.05);2.宫颈癌组、HSIL组、LSIL组、健康对照组血清中的miR-1266表达情况。(1)宫颈癌组与健康对照组相比,miR-1266的表达水平是升高的,差异具有统计学意义(P<0.05);(2)HSIL组与健康对照组相比,miR-1266的表达水平是升高的,差异具有统计学意义(P<0.05);(3)LSIL组与健康对照组相比,miR-1266的表达水平是升高的,差异具有统计学意义(P<0.05);3.Kaplan-Meier生存分析结果显示,50例宫颈癌患者中,低水平miR-1266病人组与高水平miR-1266病人组相比有较长的生存期,差异具有统计学意义(P<0.05)。小结miR-1266与宫颈癌患者的生存预后具有明显的相关性。第二部分:miR-1266通过靶向调控DAB2IP参与宫颈癌细胞生存、增殖、迁移和侵袭能力的体外实验研究目的1.探讨miR-1266对宫颈癌细胞生存、增殖、迁移和侵袭能力的影响;2.探讨宫颈癌中miR-1266与DAB2IP之间的关系;3.探讨miR-1266是否能够通过靶向调控DAB2IP的表达,进而参与宫颈癌细胞生存、增殖、迁移和侵袭能力的调节。方法1.通过Target Scan、miRDB、miRanda这三个生物学靶标预测网站分析miR-1266可能的下游靶标,并对数据结果进行Venn分析;2.采用Western blot技术检测宫颈癌组和对照组宫颈组织中DAB2IP蛋白的表达水平;3.采用Pearson相关系数分析宫颈癌组织中miR-1266和DAB2IP的相关性;4.采用双荧光素酶报告基因实验,将含有DAB2IP基因3′-端非编码区(Untranslated Regions,UTR)野生型序列(WT-DAB2IP 3′-UTR)或突变型序列(MUT-DAB2IP 3′-UTR)的荧光素酶报告载体分别与miR-1266 mimics或miR-negative control(Negative Control,NC)共转染入宫颈癌细胞He La和Si Ha,每种细胞分为4组:(mimics+WT)组、(mimics+MUT)组、(NC+WT)组、(NC+MUT)组。检测各组细胞的相对荧光素酶的活性,并验证预测结果;5.培养宫颈癌细胞系He La和Si Ha,每种细胞分为3组:miR-1266模拟物组(mimics)、抑制物组(inhibitor)、阴性对照组(NC);采用CCK-8法、克隆形成实验、划痕修复实验和基质胶侵袭实验,检测各组细胞的生存、增殖、迁移和侵袭能力;6.培养宫颈癌细胞系He La和Si Ha,采用脂质体Lipofectamine 2000转染DAB2IP过表达质粒,每种细胞分为3组:共转染miRNA-1266 mimics和DAB2IP过表达质粒组(mimics+plasmid)、共转染miRNA-1266 mimics和空白质粒组(mimics+control plasmid)、共转染miRNA-1266阴性对照物和DAB2IP过表达质粒组(NC+plasmid);采用Western blot法检测各组细胞DAB2IP的表达水平;采用CCK-8法、克隆形成实验、划痕修复实验和基质胶侵袭实验,检测各组细胞的生存、增殖、迁移和侵袭能力。7.采用SPSS 21.0和Graph Pad Prism 5.0软件进行数据的统计和分析,所有数据计量资料均采用?x±s表示,数据行正态性检验。两组间数据比较采用独立样本t检验,多组间数据比较经检验方差齐性后采用方差分析。采用Pearson相关系数分析宫颈癌患者的宫颈癌组织中miR-1266和DAB2IP的相关性。以α=0.05作为检验水准。结果1.宫颈癌组和对照组宫颈组织中的DAB2IP蛋白的表达情况。宫颈癌组与对照组相比,DAB2IP蛋白的表达水平是明显降低的,差异具有统计学意义(P<0.05);2.宫颈癌组织中miR-1266和DAB2IP的关联。(1)Pearson相关系数分析发现,宫颈癌组织中miR-1266和DAB2IP蛋白的相对表达水平具有负向相关性,且相关系数r=-0.4255,差异具有统计学意义(P=0.0021);(2)生物信息学分析网站预测结果显示,DAB2IP的mRNA的3′-UTR区含有可以与miR-1266互补结合的序列,且序列是位于DAB2IP的mRNA的3′-UTR区的996位到1003位的核苷酸;(3)双荧光素酶报告基因实验结果显示,在宫颈癌细胞He La和Si Ha中,(mimics+MUT)组与(NC+MUT)组相比,相对荧光活性均没有明显变化(P﹥0.05);(mimics+WT)组与(NC+WT)组相比,相对荧光活性均降低,差异具有统计学意义(P<0.05);3.转染miR-1266的模拟物或抑制物后,宫颈癌细胞He La和Si Ha的生存、增殖、迁移和侵袭能力的变化。(1)模拟物组与阴性对照组相比,宫颈癌细胞的生存、增殖、迁移和侵袭能力均是升高的,差异具有统计学意义(P<0.05);(2)抑制物组与阴性对照组相比,宫颈癌细胞的生存、增殖、迁移与侵袭能力均是降低的,差异具有统计学意义(P<0.05);4.共转染miRNA-1266 mimics和DAB2IP过表达质粒后,DAB2IP过表达实验中DAB2IP蛋白的表达水平和宫颈癌细胞的生存、增殖、迁移和侵袭能力的变化。(1)(mimics+plasmid)组与(mimics+control plasmid)组相比,DAB2IP蛋白的表达水平是升高的,差异具有统计学意义(P<0.05);(mimics+plasmid)组与(NC+plasmid)组相比,DAB2IP蛋白的表达水平是降低的,差异具有统计学意义(P<0.05);(2)(mimics+plasmid)组与(mimics+control plasmid)组相比,宫颈癌细胞的生存、增殖、迁移与侵袭能力是降低的,差异具有统计学意义(P<0.05);(mimics+plasmid)组与(NC+plasmid)组相比,宫颈癌细胞的生存、增殖、迁移与侵袭能力是升高的,差异具有统计学意义(P<0.05)。小结miR-1266能够通过靶向调控DAB2IP的表达,进而促进宫颈癌细胞的生存、增殖、迁移和侵袭的能力。第三部分:miR-1266促进宫颈癌生长的体内实验研究目的第二部分通过体外细胞实验已经明确miR-1266能够在宫颈癌细胞中发挥促癌作用,因此本部分进一步通过构建宫颈癌裸鼠移植瘤动物模型,探讨miR-1266能否在体内促进肿瘤的生长。方法1.培养宫颈癌细胞系He La,转染miR-1266 mimics或阴性对照物;2.建立宫颈癌裸鼠动物模型:选取10只雌性裸鼠随机分为两组,每组5只,即为实验组和对照组。实验组:在裸鼠背侧近右后肢皮下接种经过转染miR-1266模拟物的He La细胞;对照组:在裸鼠背侧近右后肢皮下接种转染阴性对照物的He La细胞;3.注射后每4天监测裸鼠生长情况、饮食情况,测量移植瘤的体积大小及体重变化,持续28天,共7次;4.28天后处死裸鼠,取出宫颈癌瘤体,测量体积并称重,根据测量的瘤体体积绘制肿瘤生长曲线;5.采用q RT-PCR法检测宫颈癌瘤体内miR-1266的表达水平6.统计方法见第一部分。结果1.宫颈癌瘤体的体积在实验组和对照组裸鼠中的大小情况。实验组与对照组相比,裸鼠形成的宫颈癌瘤体的体积较大,差异具有统计学意义(P<0.05);2.宫颈癌瘤体的重量在实验组和对照组裸鼠中的高低情况。实验组与对照组相比,裸鼠形成的宫颈癌瘤体的重量较高,差异具有统计学意义(P<0.05);3.miR-1266在实验组和对照组的宫颈癌瘤体组织中的表达情况。实验组与对照组相比,在裸鼠的宫颈癌瘤体中miR-1266的表达水平是升高的,差异具有统计学意义(P<0.05)。小结miR-1266在裸鼠体内发挥促癌作用,可能是宫颈癌潜在的治疗新靶点。