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目的：研究免疫抑制剂环孢菌素A(CsA)与钙离子通道拮抗剂汉防已甲素(Tet)单独及联合应用对人慢性粒细胞白血病急性红白血病变细胞株K562及其耐药细胞株K562/A02耐药基因(P-glycoprotein,P-gp)表达的影响,探讨它们联合逆转多药耐药的作用机制,为环孢菌素A和汉防已甲素作为耐药逆转剂的临床应用提供理论依据。
方法：1.甲基四唑蓝法(MTT)法检测CsA(1mg/L)和Tet(0.1mg/L)单独及联合作用于K562细胞及K562/A02细胞一定时间后柔红霉素(DNR)对细胞的半数抑制量(IC_(50))。2.流式细胞仪(FCM)法检测K562细胞、K562/A02细胞、CsA(1mg/L)和Tet(0.1ing/L)单独及联合作用于K562/A02细胞一定时间细胞内DNR的浓度。3.FCM法检测CsA(1mg/L)和Tet(0.1mg/L)单独及联合作用于K562/A02细胞一定时间细胞的凋亡率。4.FCM法检测K562细胞、K562/A02细胞、CsA(1mg/L)和Tet(0.1mg/L)单独及联合作用于K562/A02细胞一定时间细胞膜上P-gp的表达。5.RT-PCR法检测K562细胞、K562/A02细胞、CsA(1mg/L)和Tet(0.1mg/L)单独及联合作用于K562/A02细胞一定时间细胞mdrl基因(多药耐药基因)mRNA表达水平。
结果：1.逆转剂CsA(1mg/L)和Tet(0.1mg/L)处理前后DNR对K562、K562/A02细胞株的毒性作用：(1)K562细胞、K562/A02细胞IC_(50)分别为0.27mg/l、21.22mg/l;(2)CsA(1mg/L)和Tet(0.1mg/L)分别作用于K562/A02细胞的IC_(50)分别为7.83mg/L和5.32mg/L,两药联合作用IC_(50)为2.33 mg/L;CsA和Tet单独及联合应用对K562的IC_(50)无明显影响。2.FCM检测细胞内DNR浓度：(1)耐药株K562/A02细胞内DNR浓度为敏感株K562的18％；(2)CsA(1mg/L)和Tet(0.1mg/L)单独及联合作用于K562/A02细胞48小时后细胞内DNR的浓度分别为K562的36％、65％和98％。CsA和Tet联合作用于K562/A02细胞一定时间细胞内DNR的浓度明显增加,与K562/A02细胞对照组间有显著性差异。3.FCM法检测细胞凋亡率：(1)K562/A02细胞对照组48小时凋亡率为2.19％；(2)DNR(1mg/L)作用于K562/A02细胞凋亡率为2.70％,与对照组无明显差异；(3)CsA(1mg/L)、Tet(0.1mg/L)及两药联合与DNR(1mg/L)共同作用于K562/A02细胞48小时后细胞凋亡率分别为10.27％、17.64％和52.79％。结果显示小剂量CsA和Tet均可诱导部分细胞凋亡,两药联合有协同作用。4.FCM检测细胞膜上P-gp的表达变化：(1)K562细胞、K562/A02细胞膜P-gp的荧光强度分别为0.18和96.51：(2)CsA(1mg/L)和Tet(0.1mg/L)单独及联合作用于K562/A02细胞48小时后P-gp的表达分别为75.32％,76.86％和48.61％。CsA和Tet处理过的耐药细胞株P-gp的表达下调,两药联合作用更明显。5.RT-PCR法检测细胞mdrl基因mRNA表达：(1)K562细胞mdrl mRNA表达为阴性,K562/A02细胞mdrl mRNA表达为阳性；(2)K562/A02细胞的空白对照组mdrl/β-actin为1.348,DNR组为1.319,CsA组为1.160,Tet组为0.954,两药联合组为0.440。经过分析CsA及Tet单独作用后耐药株mdrlmRNA下调微弱,联合用药下调效果明显。数据资料以X±SD表示,用SPASSl3.0统计软件对数据进行统计分析,判断均数差异显著性,P<0.05差异有显著性,P>0.05差异无统计学意义。
结论：1.K562/A02细胞膜P-gp的表达明显高于K562细胞,K562/A02细胞mdrlmRNA表达为阳性,而K562mdrl mRNA表达为阴性,P-gp的表达参与了K562/A02细胞的耐药机制；2.有效逆转浓度的环孢菌素A及汉防已甲素均可逆转耐药,且联合作用效果更强。