自然界的天然毒素是人类可以利用的宝贵资源。目前，自然界的动物毒素尤其是蜘蛛毒素已引起相关科学工作者浓厚兴趣。蜘蛛毒素种类繁多、功能多样，在神经生物学和药理学等方面具有重要的应用前景。近年来，对蜘蛛毒素的研究取得了重大进展，用电压钳和膜片钳等电生理技术对许多作用于细胞膜上的电压门控离子通道如钾、钠、钙离子通道的毒素的性质进行了分析。这些技术已成为研究毒素作用机理的主要方法。但电压钳和膜片钳技术用于鉴定毒素的结合蛋白质时具有一定的局限性，因为它们往往是定向的使用不同类型的离子通道或其亚型去探测蜘蛛毒素的活性。在本研究中，我们选取一种具有代表性的蜘蛛神经毒素虎纹捕鸟蛛毒素-I(HWTX-I)为材料，采用基于生物素标记的策略，通过检测和鉴定HWTX-I在神经细胞质膜上的结合蛋白(泛称受体)的方法探讨HWTX-I的功能，从而获得关于HWTX-I作用机理的更直接的信息。　　 HWTX-I是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化出的一种分子量为3.75 kDa的多肽神经毒素。它由33个氨基酸残基组成，含3对二硫键。电生理实验表明它能可逆性阻断小鼠膈神经-膈肌标本的神经肌肉接头传递。为了检测它在膈神经-膈肌的神经肌肉接头中的受体，本文利用EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin对纯化的HWTX-I进行标记，再利用生物素化的HWTX-I(biotin-HWTX-I)与富含神经肌肉接头的大鼠膈肌细胞膜的蛋白质作用。通过两种方式分离和鉴定与biotin-HWTX-I结合的蛋白质。一种是用biotin-HWTX-I与制备的质膜碎片孵育再用交联剂BS3进行交联，然后用含去污剂的缓冲液提取蛋白质并用SDS-PAGE进行分离。凝胶电泳分离的蛋白质转至PVDF膜上后用与辣根过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白(HRP-avidin)检测和显影。另一种方法是先将大鼠膈肌细胞质膜的蛋白质提取并进行SDS-PAGE分离，转膜后对PVDF膜上的蛋白质进行复性处理，再与biotin-HWTX-I进行孵育，最后用HRP-avidin检测和显影。对两种方法中显现的条带的蛋白质用CapLC-MS/MS进行分析鉴定。　　 生物质谱和电生理技术证明本研究中制备的biotin-HWTX-I为标记上一个生物素基团的修饰产物，生物素标记未影响其生物学活性。在分析结合蛋白的第一种方法中，利用HRP-avidin在PVDF膜上大约72 kDa，的位置显示出条带，提示该条带很可能含有HWTX-I的结合蛋白。为了检测蛋白质中是否含有内源性抗生物素蛋白的结合位点，我们利用未标记的HWTX-I以及不用HWTX-I的空白对照进行了实验。结果表明两种情况下都在相同的位置有条带显现，且未标记HWTX-I存在时的条带颜色比不用HWTX-I时的条带颜色浅。这说明质膜蛋白质本身具有内源性抗生物素蛋白结合位点，而且抗生物素蛋白的结合位点很可能与HWTX-I的相同或大部分重叠。在分析HWTX-I受体的另一种方法中，膜蛋白被提取、SDS-PAGE分离和转至PVDF膜上后才用biotin-HWTX-I进行检测。为了研究蛋白质复性处理对HWTX-I与蛋白结合的影响，对HWTX-I与膜上蛋白质复性处理前后的结合差异进行了比较。结果表明，对膜上蛋白质进行复性处理后HWTX-I与蛋白质的结合增强。与此同时，我们还利用HRP-avidin在不同实验条件下检测PVDF膜上的蛋白质或biotin-HWTX-I，高浓度的抗生物素蛋白并不能完全阻断HWTX-I与潜在的结合位点的结合(反之亦然)，这进一步验证了avidin和HWTX-I在结合蛋白质中的结合位点并不完全重叠。　　 将HRP-avidin显现的条带中的蛋白质用胰蛋白酶消化和CapLC-MS/MS分析后，鉴定到HWTX-I的几种候选结合蛋白，包括电压门控Ca2+通道蛋白，电压依赖的阴离子选择性通道蛋白，Ca2+ATP酶和膜联蛋白等，提示HWTX-I可能通过与多种膜蛋白或离子通道蛋白作用阻断神经肌肉接头传递。