干细胞是指能够相对无限或较长时间自我更新的细胞，并且新复制的细胞可以分化成一种以上的功能细胞系。而神经干细胞(neuralstemcell，NSC)则是指能够自我复制和具有神经定向分化能力的细胞。自然的NSC分裂分化活动受到多种因素的调节，主要分为内因和外因两方面。内因主要是影响细胞周期和各种细胞周期因子，诸如Notch信号、Math基因家族、gp130/JAK/stat3、骨形态发生蛋白信号途径等，外因受细胞因子和微环境的影响。目前，对NSC分化研究侧重于细胞因子及内环境信号的作用。不同种类的细胞因子、同一细胞因子不同浓度以及多种细胞因子联合应用对NSC诱导分化作用各不相同，且不同阶段，相同细胞因子的作用亦不同。 研究表明钙通道在神经发育过程中具有重要作用，例如：神经锥生长、神经元的迁移、轴突和树突的延伸、突触可塑性等。Gage等在培养的胚胎E16天的海马前体细胞上记录到了电压依赖性钙电流，并且有报道电压依赖性钙通道参与了胚胎海马神经前体细胞向神经元分化的调控。 近年来，大量的研究表明，TRP通道作为一类新发现的Ca2+摄入途径，在调节胞内Ca2+平衡，传递胞外信号方面发挥重要作用。最近，多个工作证明TRP通道介导了神经元生长锥的转向。Greka等报道，TRPC5可以调节海马神经突起的长度及生长锥的形态。Bezzerides等报道，在海马神经元中，神经生长因子等可以诱导TRPC5快速转运到细胞膜上，并影响神经突起的延伸。2005年，蒲慕明实验室报道TRP通道的激活，使得钙离子浓度升高，引起netrin-1和BDNF介导的生长锥的转向。很显然，随着研究的深入，更多的TRP通道在发育中的重要作用将被揭示出来。 本研究的目的主要是建立并纯化胚胎神经干细胞的培养方法，并观察TRP通道阻断剂镧、SKF96365对胚胎神经干细胞增殖和分化的影响，探讨TRP通道在调控胚胎神经干细胞分裂分化中的作用。 本实验分离孕鼠大脑半球，制成单细胞悬液，培养胚胎神经干细胞，利用无血清培养技术，在添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、B27supplement的DMEM/F12培养液中悬浮培养，连续传代。培养的胚胎神经干细胞，球体透亮，边缘整齐，细胞排列紧密。在位于球边缘的细胞膜上，还可见到睫毛状小突起，随着培养神经细胞球渐变大。和一般的细胞相比，神经干细胞具有细胞核相对较大，胞浆少的特点。分别取原代和传代培养的细胞做免疫荧光鉴定，发现均有细胞表达巢蛋白(nestin)抗原，传至第三代细胞nestin阳性率可达99％。我们观察了3-5代的细胞在细胞形态及增殖速率上没有明显的变化，以下实验均取用3-5代的细胞。 在细胞培养液中加入5umol/L的BrdU，作用2小时，免疫荧光双标BrdU与nestin发现细胞共表达这两种抗原，说明细胞处于活跃的分裂增殖期。 将干细胞培养基换成分化培养基，诱导细胞分化。分化2天后，镜下观察细胞长出突起，已初步具有神经元和胶质细胞形态，细胞免疫荧光分别呈DCX和S-100β阳性。Doublecortin(DCX)是未成熟神经元的标志物，它位于细胞体的周边部，与微管重叠。S-100β是一种神经胶质细胞分泌的钙活性蛋白质。细胞克隆球来自神经系统，可分化为神经元、胶质细胞；能自我复制，证实所培养的细胞为神经干细胞。 MTT检测结果：分别加入不同浓度的TRP通道阻断剂LaCl3和SKF96365处理细胞。其OD值分别为control组的81.39％、75.56％、61.01％及87.76％、83.95％、74.93％，呈浓度依赖性降低。免疫荧光DAPI染色及流式细胞仪实验显示，LaCl3不引起细胞死亡，免疫荧光DAPI染色也证实SKF96365不引起细胞死亡。结果表明LaCl3和SKF96365对神经干细胞的数量有影响，可降低胚胎神经干细胞的数量。 细胞免疫荧光检测结果：把单细胞悬液接种于经PLL包被的培养板上，加入5umol/L的BrdU2小时后，加入不同浓度LaCl3处理30分钟，通过免疫细胞化学计数BrdU阳性细胞的数量。25uMLa组、50uMLa组、100uMLa组，BrdU阳性细胞数分别为control组的62.99％、59.54％、44.83％，与control组比较有统计学意义。可见LaCl3可抑制神经干细胞的增殖，且呈浓度依赖性。 流式细胞仪检测结果：增殖指数(proliferationindex，PI)表示细胞增殖活性，其计算公式为：PI％=(S+G2/M)÷(GO/GI+S+G2/M)×100％。通过计算得出control组其PI为50.40％，LaCl3处理组PI为36.20％。实验结果进一步表明LaCl3可抑制神经干细胞的增殖。 对细胞分化的影响：把单细胞悬液接种于经PLL包被的培养板上，先加入5umol/L的BrdU2小时后，再加入不同浓度LaCl3，在分化培养基中培养4天后，对细胞进行免疫标记BrdU和DCX或BrdU和S-100β，分别计数BrdU、DCX及S-100β阳性细胞的数量。 LaCl3处理后BrdU阳性细胞数量减少，DCX或S-100β阳性细胞数量增加。25uMLa组、50uMLa组、100uMLa组DCX阳性细胞数分别比control组增加9.41％、38.68％及45.04％。S-100β阳性细胞数分别比control组增加42.50％、75.00％及82.50％。实验结果表明，LaCl3可促进神经干细胞的分化。 以上实验结果表明TRP通道阻断剂LaCl3抑制胚胎神经干细胞的分裂增殖，促进其分化。