清代名医陈士铎在《辨证录》健忘门中云,“人有老年而健忘者,近事多不记忆,虽人述其前事,犹若茫然,此真健忘之极也。人以为心血之涸,谁知是肾水之竭乎?夫心属火、肾属水,水火似乎相克,其实相克而妙在相生,心必藉肾以相通,火必得水而既济。如止益心中之血,而不去填肾中之精,则血虽骤生,而精仍长涸,但能救一时之善忘,而不能冀长年之不忘也。治法必须补心,而兼补肾,使肾水不干,自然上通于心而生液”,“夫心肾交而智能生,心肾离而智能失,人之聪明非生于心肾,而生于心肾之交也。肾水资于心,则智能生生不息;心火资于肾,则智能亦生生无穷。苟心火亢,则肾畏火炎而不敢交于心;肾水竭,则心恶水干而不敢交于肾,两不相交,则势必至于两相忘矣。”所述凸显了“补肾”治法在防治老年性痴呆中的重要作用。科研团队的前期研究也证实,肾精亏虚为AD发病的主要诱因,肾之精气的盛衰直接关系到脑髓的盈亏及大脑功能的正常发挥。天丝饮出自《辨证录·卷四—健忘门》,由巴戟天和菟丝子组成,具有补肾益智之效。目前关于天丝饮治疗AD的相关研究工作尚显匮乏,为了探寻天丝饮治疗AD的药效物质基础及作用机理,本文首先从生物信息学角度,采用网络药理学方法推测天丝饮治疗阿尔茨海默症的主要成分以及分子生物学机制;接着选用LC-MS方法对所推测成分进行验证,并对成分进行初步定量分析;然后选用模式生物秀丽隐杆线虫,进行氧化胁迫、瘫痪缓解以及寿命实验,评价天丝饮在抗氧化、抑制?-淀粉样蛋白毒性和延长寿命方面的药理活性,用HPLC-MS分析天丝饮进入线虫体内的成分,最后用TMT蛋白质组学技术研究天丝饮诱导的秀丽隐杆线虫蛋白差异表达,为进一步研究天丝饮的作用机理提供理论及实验基础。方法:1.天丝饮治疗AD的网络药理学研究:在TCMSP数据库中,以疾病AD作为研究对象,反推巴戟天、菟丝子中与AD相关的所有成分,比较成分之间ADME参数差异,通过网络药理学方法建立天丝饮的“成分-靶点”网络,“靶点-通路”网络以及PPI网络,最后对候选靶点进行GO和KEGG富集分析,探讨天丝饮治疗AD的作用机理。2.天丝饮的中药化学研究:首先采用紫外-可见分光光度法测定天丝饮的总黄酮含量。然后采用HPLC法,以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相,比较对照品的保留时间和最大吸收波长,对天丝饮化学成分进行定性分析。再采用UHPLC-QQQ-MS法建立各对照品的标准曲线,测定其主要有效成分在天丝饮中的含量。3.天丝饮的药理作用:秀丽隐杆线虫作为模式生物,通过百草枯氧化胁迫实验,筛选出天丝饮水煎液具有抗氧化作用的最佳浓度,开展寿命实验进一步确认天丝饮的药理作用。选用CL4176秀丽隐杆线虫进行瘫痪缓解实验,筛选缓解Aβ毒性的最佳药物浓度。4.天丝饮的药物摄取研究:秀丽隐杆线虫以最佳给药剂量(天丝饮水煎液)处理24h后,收集虫体,研磨后经蛋白质沉淀前处理,采用UPLC-QQQ-MS分析技术对秀丽隐杆线虫体内药物摄取情况进行检测。通过设定质谱条件和比较保留时间对体内成分进行定性分析和相对定量。5.天丝饮诱导的秀丽隐杆线虫蛋白质组学研究:将约8000条L1期的秀丽隐杆线虫转移至涂有天丝饮NGM板中,以加入S.Medium的NGM板作用空白对照,当线虫培养至产卵期时,洗去表皮残留的大肠杆菌和药物,放入1.5 mL离心管中保存。将2组秀丽隐杆线虫样本进行TMT肽段标记,质谱鉴定,应用KOBAS软件分析两组差异表达蛋白质的生物信息学。结果:1.利用网络药理学方法分析得到天丝饮中与AD相关的成分203种,筛选后得到13种,其中8种成分归属巴戟天,5种成分归属菟丝子。将从CTD、Innate、GenAge数据库中获取的关于AD、炎症、衰老相关的靶点与Swiss Targetprediction预测的天丝饮成分对应的靶点合并,得到8个重叠靶点,即ABL1、PTGS2、AKT1、PIK3R1、PIK3CA、IGF1R、HIF1A、PTK2。通过KEGG通路富集分析得到候选靶点主要富集在内分泌抵抗(Endocrine resistance)通路。2.选取了8个对照品,用UHPLC-QQQ-MS进行定量,含量分别为:金丝桃苷0.2963%;绿原酸0.2352%;水晶兰苷0.1688%;紫云英苷0.0891%;山奈酚0.0390%;去乙酰基车叶草苷酸甲酯0.0059%;槲皮素0.0010%;异鼠李素0.0001%。天丝饮总黄酮含量为1.83%。不同浓度的天丝饮水煎液对DPPH自由基的清除效果有差异,浓度在0.2 mg/mL~25 mg/mL之间,变化较明显;25 mg/mL~50 mg/mL之间,变化趋于平缓。3.秀丽隐杆线虫百草枯氧化胁迫实验选取了天丝饮水煎液的8个浓度,结果显示8 mg/ml为最佳浓度。瘫痪缓解实验结果显示,0.8 mg/mL~32 mg/mL均可延缓CL4176秀丽隐杆线虫瘫痪,3.2 mg/mL为最佳浓度。而在160 mg/mL和320 mg/mL时,由于药物浓度较大,可能产生了毒性作用。最后,16 mg/mL天丝饮和金丝桃苷能显著延长野生型秀丽隐杆线虫N2的寿命。4.通过UHPLC-QQQ-MS方法,鉴定了6个天丝饮的秀丽隐杆线虫药物摄取成分。含量分别为金丝桃0.375μg/mL、绿原酸0.5831μg/mL、水晶兰苷0.691μg/mL、紫云英苷0.1131μg/mL、山奈酚0.0995μg/mL、异鼠李素0.0556μg/mL。5.两组样本共鉴定出3349个蛋白点。与空白组比较,天丝饮组差异表达明显的蛋白共563个,其中正调控蛋白277个,负调控蛋白286个。基因本体(GO)分析表明,这些差异表达蛋白主要参与细胞角质层构成、脂肪酸生成、ATP结合、DNA结合等生物过程。KEGG通路分析进一步表明,这些蛋白主要集中于药物代谢-细胞色素P450,不饱和脂肪酸的生物合成,脂肪酸代谢,谷胱甘肽代谢通路。结论:本文首先应用网络药理学技术,评价天丝饮治疗老年痴呆方面的药效作用。结合网络药理学筛选出的成分与文献,选择8个化合物作为中药化学分析对象。对天丝饮中的8个主要成分进行了含量测定。此外,运用TMT蛋白质组学技术探讨被秀丽隐杆线虫摄取的天丝饮中的主要小分子活性成分,揭示了天丝饮主要通过调控秀丽隐杆线虫中vit-5、vit-1、vit-3、vit-4、acdh-1、gst-31、gst-27、gst-24、gst-5、gst-13、gst-12、gst-38、gst-10、scl-2等蛋白表达激活或抑制,药物代谢-细胞色素P450,不饱和脂肪酸的生物合成,脂肪酸代谢通路,从而发挥药效。