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研究背景自身免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis;AIH）是一种慢性、免疫介导的非特异性肝脏炎症。流行病学统计表明,我国AIH发病率高达20/10万,北欧白人年均发病率为1.071.9/10万[1]。其病因与多种遗传和环境因素相关,但尚未完全阐明。自身免疫型肝炎的易患对象包括了世界各地的儿童和成人,其特点是病因和临床异质性,这有别于其他类型的自身免疫性肝病如原发性胆汁性肝硬化（primary bile cirrhosis;PBC）和原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis;PSC）,少数病例也和PBC或PSC有重叠的特征。长期未治疗的AIH与肝硬化和/或肝细胞癌（HCC）的风险增加有关,死亡率极高,因此,快速和及时的诊断是非常重要的[2]。尽管AIH的临床诊断标准已经建立并得到广泛地验证,但由于自身抗体的可变性,仍有部分不典型的自身免疫型肝炎如自身抗体阴性AIH、药物诱导的AIH、重叠综合征（同时表现出AIH和PBC或PSC的特征）以及移植术后新发的AIH等难以依赖现有的AIH诊断标准进行诊断或观察疗效[3]。近年来,微生物领域的蓬勃发展使微生物在许多疾病的发病机制、诊断或治疗中的地位不断提高。目前,人体内的微生物群落已被认为是极易受到周围环境影响的部分,成千上万的微生物正在逐渐形成一个独特的系统,潜移默化地影响宿主的免疫功能和代谢[4]。近年来,以微生物组成和功能紊乱为特征的肠道菌群改变与自身免疫性疾病如类风湿关节炎（rheumatoid arthritis;RA）[5]、自身免疫性肝病（autoimmune liver disease;AILD）[6,7]、多发性硬化（multiple sclerosis;MS）[8]和 1 型糖尿病（type 1 diabetes;T1D）[9]有关。随着时间的推移,人类微生态学在多种疾病的预防和治疗领域中的地位不断增强,越来越多的专家将目光投向人类微生物群落的相关研究。考虑到近年来大量研究发现的人类微生态系统与某些慢性肝病之间存在的密切联系,我们随即提出了一个疑问:自身免疫性肝炎（AIH）患者的肠道以及口腔微生物群落的组成和分布是否与正常人群的微生物群落存在差异?如果差异存在,那么是否有可能利用肠道或口腔微生物作为无创的生物标志物对自身免疫型肝炎患者与健康人群进行区分?首先,以小鼠模型为基础的相关实验为肠道微生物参与AIH的发生和发展过程奠定了基础[10]。此外,最近一项研究中对91例AIH患者和98例健康对照进行了 16S rRNA基因测序,发现AIH患者肠道微生物α多样性较低,微生物组成明显不同于健康人群[6]。先前的实验与研究都支持了肠道微生物对AIH诊断的重要意义。而在口腔微生态方面,口腔微生物菌群的异常不仅对口腔疾病（如牙科、牙周炎、口腔炎、口腔粘膜疾病）有影响,而且还涉及包括胃肠道炎性疾病（IBD）（Said HS,2014）[11]、肝硬化（LC）（Bajaj JS,2015）[12]、胰腺癌（Ren Z,2017）[13]、神经系统疾病（如阿尔茨海默氏病）（AD）（AguayoS,2018）[14]、内分泌系统疾病如糖尿病（Xiao,2017）[15]、不良妊娠结局（Corwin EJ,2017）[16]、肥胖和多囊卵巢综合征（Akcali A,2014）[17]、类风湿性关节炎（RA）（Zhang X,2015）[18]等免疫系统疾病和动脉粥样心血管系统疾病（AS）（Koren 0,2011）[19]。大量已发表的文献显示了口腔微生物在多种疾病的发生发展过程中发挥着重要作用,但是,目前为止,AIH患者的口腔微生物还没有被科学地研究过,这一领域缺少充分的系统的随机对照实验,因此,我们对口腔微生物在AIH领域的研究是有依据且有必要的。此外,地域差异是肠道微生物差异的重要影响因素[20]。在此,我们旨在确定华中地区AIH患者与HCS之间肠道与口腔微生物群的差异,并验证肠道与口腔微生物群作为AIH诊断工具的有效性。目的本课题旨在确定中国中部地区的自身免疫性肝炎（AIH）患者与健康对照组（HCs）肠道及口腔微生物群的差异,并验证肠道与口腔微生物群作为自身免疫性肝炎的无创诊断工具的有效性。方法我们前瞻性地在郑州大学附属第一医院感染性疾病科和体检科收集了 115例粪便样本和138例唾液样本,其中包括AIH患者的粪便样本（n=37）,匹配的健康对照者（HCs）的粪便样本（n=78）,46例AIH患者的唾液样本（n=46）和匹配的健康对照者的唾液样本（n=92）,对所有粪便和唾液样本进行了 16S rRNA基因测序。随后,为了探索粪便及唾液的微生物的组成特征并确定AIH的微生物标志物,我们进行了一系列的微生态数据分析,包括物种组成分析、α多样性分析和β多样性分析等。具体步骤如下:（1）参与者的筛选与临床特征;（2）样本采集与DNA提取;（3）PCR扩增、MISEQ测序;（4）序列数据处理;（5）细菌多样性与分类学分析;（6）基因功能预测;（7）确定OTU生物标志物与疾病概率;（8）统计学分析。结果1.肠道微生物多样性与HCs相比呈下降趋势。两组间肠道微生物群落差异显著。在门水平上,与HCs相比,AIH组的患者肠道中的抚状菌（Verrucomicrobia）丰度显著增加,而Lentisphaerae和Synergistetes显著降低。与HCs相比,在 AIH 组的患者中,包括 Veillonella、Facalibacterium和Akkermansia在内的 15个属富集,而 Pseudobutyrivibri、Lachnospira和Ruminococaceae等19个属减少。在随机森林模型上,通过五次交叉验证,确定了最优的5个微生物标记,分别为 Lachnospiraceae、Veillella、Bacteroides、Roseburia和Ruminococaceae,五种微生物生物标志物被认为是AIH的最佳诊断工具。与HCs组相比,AIH组的POD指数明显升高,并且这5种微生物标志物对自身免疫性肝炎的诊断模型达到83.25%的曲线下面积。2.口腔微生物群的多样性在AIH组患者中明显高于HCs组。口腔微生物群落分布在两组间有显著差异。我们发现包括Fusobac terium,Ac tinomyces,Capnocytophaga,Peptostreptococcus,IncertaeSedis,Sol obac teri um和Sphingomonas在内的7个属在HCs组占优势;相应地,包括Streptococcus,Veillonella,Leptotrichia,Gemella,Aggregatibacter,Selenomonas和Rothia在内的51种细菌属在AIH组中显著富集,被认为是微生物优势属。值得注意的是,在基因功能分析中,有41种基因功能在AIH组中明显富集,包括6磷酸果糖激酶1,乳酸脱氢酶,丙酮酸脱氢酶和L丝氨酸脱水酶等;而有21种基因功能在HCs组明显富集。在随机森林模型上,通过五次交叉验证,确定了最优的5个微生物标记,分别为OTU412（Selenomonas）、OTU277（Corynebacterium）、OTU315（Leptotrichia）、OTU42（Rothia）和 OTU484（Selenomonas）,并在46个AIH和92个HCs样品之间达到了 99.88%的曲线下面积。结论1.本研究首次分析了中国中部地区AIH患者的肠道及口腔微生物表征。一方面,包括lachnospiraceae、veillella、bacteroides、Roseburia 和ruminococaceae在内的五种肠道微生物标志物,对AIH患者具有很高的诊断潜能,可用于区分AIH患者和健康人群。另一方面,Selenomonas、Corynebacterium、Leptotrichia和Rothia的口腔微生物组合被认为是区分AIH患者和健康人群的有效的诊断标志物。2.本研究重点突出了肠道和口腔微生物群对AIH强大的诊断潜能,为未来临床工作中对AIH的诊断,提供了一种全新的诊断策略。值得注意的是,这是首次将AIH患者与健康人群的肠道及口腔微生物结合起来进行分析研究,为未来AIH的微生物研究领域提供了依据,并为我们今后进一步深入研究人体微生态影响自身免疫性肝炎的具体机制打下了一定基础。