胃癌严重威胁着人类的健康，其治法极其有限并且75%的患者在确诊时已经到不能通过手术治疗的阶段。即使实施根治性切除并联合放化疗也有近60％的致死率。并且在治疗过程中疗效与副作用间的矛盾也令医者进退两难。基于腺病毒的基因治疗已广泛的进入到临床前及临床研究。溶瘤病毒治疗为那些传统方法治疗无效的患者重然生机。如条件性增殖腺病毒（conditional replication-competent adenovirus, CRCA）等方法已在临床前及临床实验中开展并得到越来越多的关注，其主要原因为这种载体右以选择在癌细胞中启动并且有能力在临近的肿瘤细胞复制及扩散。此外感染CRCA后可产生抗肿瘤免疫应答，这也可对放疗及化疗产生互补。更重要的是CRCA还可以通过携带相应的治疗基因对原发和转移癌同时奏效。然而这种疗法并不足够的效力及相对缺乏的特异性靶向癌症基因治疗中的一大难题及开发抗癌新疗法的关注重点。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）启动子在永生化细胞及超过85%的人类癌症细胞中高度活跃，因此被广泛的应用于CRCA的构建中。在本研究中所采用的早期区1A基因（early region1A，E1A）是腺病毒构建中应用最广泛也是病毒本身复制所必需的基因，它担任着病毒感染后调节病毒复制和细胞周期的重要角色。研究中，我们关注描述双特异性抗癌溶瘤腺病毒Ad-hTERT-E1a-Apoptin的抗肿瘤效果，这种重组腺病毒其复制由hTERT启动子启动，可选择性的在肿瘤细胞中复制及选择性的将肿瘤细胞诱导凋亡。其抗肿瘤作用在体外感染肿瘤细胞24小时后开始奏效。在感染人胃癌SGC7901细胞4天后采用1MOI剂量的影响较小，但采用10MOI及100MOI剂量组则完全抑制了细胞生长。与之相对，人胃黏膜上皮细胞GES-1在采用Ad-hTERT-E1a-Apoptin治疗后的任何剂量均未观察到明显的生长抑制。这一结果表明Ad-hTERT-E1a-Apoptin可在SGC7901癌症细胞中特异性复制并抑制生长且对正常细胞无明显作用。癌症的治疗中有效性与特异性同等重要。凋亡素（Apoptin）是源于鸡贫血病毒（chicken anemia virus, CAV）VP3基因质量为13.6kDa的蛋白，可以选择性的诱导多种肿瘤细胞凋亡，如肝癌细胞、淋巴癌细胞、肝管上皮癌细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、口腔癌细胞和结肠癌细胞等。初步研究已经证实超过超过70种不同的人类转移癌及恶性肿瘤细胞对Apoptin所诱导的凋亡敏感。然而，Apoptin对正常的人类细胞如成纤维细胞、平滑肌细胞、T细胞、肝细胞、造血干细胞、角化细胞和内皮细胞等非转化细胞并没有相应作用。此外，有研究表明在正常人类成纤维细胞中Apoptin的长期表达并没有产生毒性及转录活性。也有研究显示Apoptin对非癌细胞也存在细胞毒性，但在这项研究中表明细胞死亡仅在胎儿细胞型中产生。此外Apoptin特异性诱导肿瘤细胞凋亡并不依赖p53。因此在p53缺乏及表达野生或突变型p53的肿瘤细胞中Apoptin同样有较强的杀伤作用。Apoptin诱导凋亡中抗凋亡分子的机制目前任是个争论问题。在某些肿瘤细胞系中Apoptin介导的细胞死亡并不依赖bcl-2而且对bcr-Abl和bcl-xL也不敏感。因此Apoptin可用于放、化疗的补充方法。所有这此因素使得Apoptin在癌症的基因治疗中倍受关注并且许多研究中已经证实Apoptin插入不同载体后可有效限制肿瘤生长。染色质凝聚及核碎裂是细胞凋亡的标志。使用荧光显微镜可对如AO/EB染色等不同方式的DNA染色进行方便快捷的检测。本研究中利用AO/EB染色法将感染重组腺病毒的SGC7901细胞生存、凋亡及坏死比例进行量化。结果显示，感染重组腺病毒后部分SGC7901细胞的生长抑制可能源于细胞坏死。因此我们推测Apoptin基因可能还有另外一些尚不明确有作用。然而Apoptin基因诱导凋亡的作用依旧明显，在感染Ad-hTERT-E1a-Apoptin重组腺病毒48小时后38.6%的细胞产生凋亡而坏死细胞比例为27.1%。相反，感染Ad-hTERT-E1a重组腺病毒48小时后尽管也有24.3%的细胞凋亡，但坏死比例占25.5%。这种结果表明尽管感染复制型重组腺病毒的细胞会产生坏死但相对于肿瘤细胞对Apoptin基因所产生的凋亡作用并不明显。细胞死亡分类的形态学检测经常联合应用两种以上的检测方法，因此研究中还应用了其他染色。Apoptin基因在人类多种癌症细胞上诱导的凋亡也是经由经典的凋亡通路。Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7是Caspase家族中的重要成员它可以在凋亡细胞中裂解主要的细胞底物并经由内在或外在途径扩大这种作用。在本项研究中采用Western blot分析检测到感染重组腺病毒SGC7901细胞中Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7的活性增高。糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glycolytic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）做为参照。所有的结果证明了Ad-hTERT-E1a-apoptin溶瘤腺病毒可以在肿瘤细胞中特异性凋亡诱导作用。研究中还对重组腺病毒在人源性胃癌裸鼠皮下荷瘤模型中的抗肿瘤作用进行评估以进一步证实及拓展体外的研究结果，实验中荷瘤人胃癌SGC7901细胞BALB/c裸鼠感染不同种的重组腺病毒。结果显示所有的重组腺病毒都有着抗肿瘤效果，但复制缺陷型腺病毒只能相对更少部分的抑制肿瘤。瘤内注射重组腺病毒Ad-hTERT-E1a-Apoptin的荷瘤鼠瘤体明显减小，而感染Ad-hTERT-Apoptin、 Ad-CMV-apoptin、Ad-hTERT-E1a或Ad-CMV-E1a的荷瘤鼠的抑瘤效果则相对不明显。这显示就用复制型腺病毒可以扩散到动物的任何瘤体组织中并且表达Apoptin基因的腺病毒也增强了溶瘤作用。当感染方式为尾静脉注射时，重组腺病毒Ad-hTERT-E1a-Apoptin虽然没有完全导致肿瘤消退，但肿瘤的增长也被明显的延迟了。瘤内注射方式的抑制作用可能也与继发CRCA感染相关。尾静脉注射重组腺病毒Ad-hTERT-Apoptin、Ad-CMV-Apoptin、Ad-hTERT-E1a和Ad-CMV-E1a的溶瘤活性相对有限，其结果与瘤内注射接近。尾静脉注射腺病毒Ad-mock及生理盐水组裸鼠未能观查到肿瘤抑制作用。另外在整个体内实验过程中并未观察到用重组腺病毒Ad-hTERT-E1a-Apoptin治疗的实验动物出现明显的毒副作用。因此数据表明重组腺病毒Ad-hTERT-E1a-Apoptin是一个安全有效的载体，可广泛应用于肿瘤治疗。总之，Apoptin基因治疗展现出其特有的肿瘤治疗优势如：（1）Apoptin基因的凋亡诱导作用不依赖p53基因；（2）Apoptin基因的凋亡诱导作用不受bcl-2或bcr-abl等凋亡抑制因子影响；（3）Apoptin基因能够激活多种下游凋亡程序因子；（4）Apoptin基因对多种类型肿瘤具有作用，以上这些优点都都表明Apoptin将会广泛应用于肿瘤治疗。另外在本研究中所应用的CRCA可选择性的诱导多种肿瘤细胞凋亡且对正常细胞无不良反应。体内外的研究数据表明在hTERT启动子驱动下表达Apoptin基因的CRCA有明显的抑瘤效果并且有更少的不良作用，这些结果都可为进一步的临床研究提供有价值线索。