研究目的:家族性肾性糖尿(FRG)是一种罕见的肾小管疾病,其特征是孤立的持续性葡萄糖尿,无糖代谢异常和任何其他近端肾小管功能障碍的症状。绝大多数FRG患者由SLC5A2基因(OMIM182381)突变所致。本研究旨在进一步扩大FRG患者的SLC5A2基因突变分析,探讨基因型与肾糖阈(RTG)之间的联系。再者,基于所报道的SLC5A2外显子变异缺乏mRNA水平的研究,本研究也探索了点突变对前体mRNA剪接的影响。研究方法:1检测9个FRG家系25位家庭成员的24小时尿葡萄糖定量和肾葡萄糖阈值。PCR法扩增SLC5A2全部编码区及其侧翼序列,直接测序法分析基因突变特点。比较不同基因型患者(杂合子和复合杂合子;c.886(-10_-31)del杂合子和其他杂合子)肾糖阈的差异。2运用生物信息学在线软件(BDGP和HSF 3.1)预测人类基因突变数据库(HGMD,2019.01)已经报道的假定的SLC5A2错义突变,筛选对经典剪接位点和剪接调控序列如外显子剪接增强子(ESEs)和外显子剪接沉默子(ESSs)有潜在影响的点突变。采用构建迷你基因的方法验证候选外显子突变对剪接的影响。研究结果:1通过直接测序,9个FRG家系共发现SLC5A2突变12个,其中新突变10 个,分别为:c.331T>C p.(Trp111Arg);c.374T>C p.(Met125Thr);c.394C>T p.(Arg132Cys);c.612G>C p.(Gln204His);c.829C>T p.(Pro277Ser);c.880G>A p.(Asp294Asn);c.1129G>A p.(Gly377Ser);c.1194C>A p.(Phe398Leu);c.1540C>T p.(Pro514Ser)和c.1573C>Tp.(His525Tyr)。9个家系中有5个家系的患者存在中国人群特有的突变c.886(-10_-31)del,等位基因突变频率高达28%(5/18)。复合杂合突变患者的RTG较杂合突变携带者低[(1.28±0.10)mmol/L比(5.14±0.77)mmol/L,P<0.001];c.886(-10_-31)del携带者的RTG较其他杂合突变携带者低[(4.43±0.37)比(5.7±0.51)mmol/L,P<0.001]。2.1通过BDGP和HSF分析了SLC5A2数据库中的77个错义突变。我们最终选取9个假定错义变异进行迷你基因分析。构建了包含3,4,6和9号外显子及内含子侧翼区的4个野生型迷你基因,并以此为基础通过定点突变构建了 7个突变型迷你基因。RT-PCR实验表明3个变异影响正常前体mRNA剪接(c.216C>A,c.294C>A和c.1129G>A)。2.2突变c.216C>A影响3号外显子5’末端下游的第18个碱基,据HSF软件分析,该序列内可能含有3个重叠的ESEs位点。该位突变可能破坏这些ESEs,并产生3个ESSs基序。c.294C>A位于3号外显子3’末端上游的第10个碱基。据HSF软件,该突变可能破坏两个ESEs,并产生4个重叠的新ESSs。RT-PCR分析表明,对照迷你基因分别产生了 368 bp和263 bp两条不同的条带,而突变型迷你基因只产生了一条263 bp的条带。测序分析该突变导致3号外显子跳跃。我们考虑这两个突变可能破坏ESEs及产生ESSs,最终导致3号外显子跳跃。2.3 c.1129G>A突变影响5’剪接位点上游9号外显子的最后一个碱基。生物信息学分析(BDGP)表明,该变异降低了 5’剪接位点的得分。我们构建了含有该外显子及侧翼内含子序列的迷你基因。RT-PCR结果分析表明突变型与野生型迷你基因产生的剪接产物存在差异。野生迷你基因产生263 bp和371 bp两个不同的产物。而突变型只产生了一条263 bp的条带,对应于mRNA中9号外显子的跳跃。因此,变异c.1129G>A废弃了供体剪接位点,进而导致9号外显子跳跃。研究结论:1在本研究中我们发现10个新的SLC5A2基因突变导致FRG,再次证明c.886(-10_-31)del是中国FRG人群特有的高频突变。复合杂合突变患者较单纯杂合突变患者表现为更低的RTG。2首次描述了SCL5A2外显子突变对前体mRNA剪接的影响。我们建议在没有获得患者RNA情况下,迷你基因分析可能是评估SLC5A2外显子变异对前体mRNA剪接影响的有价值的工具。