人口老化带来的阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)患病人数的剧增是威胁全球社保体系的最重要因素之一。AD在临床上的主要表现为空间学习记忆能力障碍、认知功能障碍、失认失用、语言障碍以及性格精神及行为发生异常等。目前全球大约有5000万患者,而预计到2050年这一数字将增到1.52亿。大量研究证实AD患者中女性多于男性,呈3:1的发病机率并且多见于绝经后的女性。因此,老化导致的雌激素(主要是17β-estradiol,E2)水平下降被认为是AD的主要致病因素之一。临床试验已经证实雌激素替代治疗(estrogen replacement therapy,ERT)在一定程度上能够逆转雌激素缺乏导致的认知功能障碍从而在一定程度上有助于AD的预防和治疗。但ERT治疗的效果还存在争议,长期的ERT还有导致乳腺癌等雌激素反应性肿瘤的风险,因此寻找在雌激素缺乏条件下预防和治疗AD新的靶点至关重要。脑是雌激素作用的重要靶区之一。脑内雌激素的来源包括来自外周循环中的雌激素(主要是卵巢雌激素),以及脑局部尤其是海马神经元经芳香化酶(aromatase,AROM)催化雄激素转变而来的雌激素即海马源性雌激素。卵巢切除术(ovariectomy,OVX)以及注射芳香化酶活性抑制剂如来曲唑(letrozole,LET)常用来制备雌激素缺乏模型,由于LET能透过血脑屏障因而也常被用来制备海马雌激素缺乏模型。我们先前的研究发现OVX和LET处理均能抑制海马CA1区树突棘密度和突触密度、调节actin细胞骨架的动态变化,提示循环雌激素和海马雌激素对海马突触可塑性均有重要的调节作用并由此改变小鼠的空间学习记忆能力,但是卵巢雌激素和海马雌激素造成小鼠行为异常是通过哪些基因改变引起的、这些基因是如何参与雌激素对小鼠空间学习记忆行为的调节等核心问题目前还未见相关文献报道。血清和糖皮质激素调节蛋白激酶1(Serum/glucocorticoid-induced protein kinase-1,SGK1)是在大鼠乳腺癌细胞受血清和/或糖皮质激素刺激时迅速转录的一种丝氨/苏氨酸蛋白激酶。SGK1广泛表达于人体内,参与调控离子通道、细胞迁移、环腺苷酸结合反应元件等转录因子的功能,并在细胞增殖与凋亡、神经元兴奋性以及激素分泌等过程中发挥重要作用。为数不多的文献报道SGK1能改善AD的相关病理,减少Aβ诱导的细胞凋亡,促进细胞存活;或是通过磷酸化调节其它蛋白如FE65减少Aβ生成及积聚的作用从而缓解AD病情。但SGK1在雌激素调控小鼠学习记忆的过程中扮演了怎样的角色尚未见文献报道。海马是与学习记忆关系最为密切的脑区之一,其突触可塑性(包括突触形态、突触密度、突触传递与突触功能的可塑性)对学习记忆能力有重要的影响,突触蛋白表达的变化是突触传递与功能可塑性的基础,肌动蛋白(actin)聚合与解聚的动态变化是树突棘密度和突触密度变化的基础。课题组的前期研究发现雌激素缺乏不仅会降低突触蛋白的表达水平也会影响actin细胞骨架聚合的动态变化。AD最主要的病理改变即为老年斑形成、神经原纤维缠结与神经元丢失,其中老年斑的形成主要是不可溶性的β淀粉样蛋白(beta-amyloid,Aβ)沉积所致。淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)可被α、β、γ分泌酶裂解,其中α分泌酶的裂解产物为可溶性的Aβ,而β、γ分泌酶的裂解产物为不可溶性的Aβ。对于不可溶性的Aβ,有研究发现它可被胰岛素降解酶(Insulin degradation enzyme,IDE)及脑啡肽酶(Neprilysin,NEP)分解。文献报道雌激素缺乏可改变Aβ代谢相关蛋白的表达水平从而加重Aβ的沉积,尽管SGK1在减少Aβ生成及积聚中也起到了非常重要的作用,但其在雌激素缺乏导致小鼠AD病理改变中的作用如何还未见文献报道。雌激素通过雌激素受体发挥调控作用,雌激素受体包括雌激素核受体(ERα和ERβ)和雌激素膜受体(G Protein-coupled Receptor 30,GPR30),课题组前期研究已经发现GPR30与小鼠突触可塑性密切相关且涉及到对mTORC2及其核心成分Rictor,但是GPR30以及Rictor的作用是否与SGK1的表达相关还不清楚。为了深入探讨雌激素调节学习记忆的机制与SGK1在其中的作用,本课题主要进行了以下研究:1.为了在转录水平探讨雌激素对海马基因表达的调节作用,我们制备了OVX和LET注射两种雌激素缺乏模型,利用转录组芯片技术对OVX和LET处理小鼠进行差异基因的筛选,结合生物信息学分析预测与雌激素作用最相关的分子,并通过WB和qPCR对芯片结果进行了验证。转录组学分析结果发现SGK1在两种雌激素缺乏模型中表达均显著下降。2.为了探究SGK1在雌激素调控小鼠学习记忆中的作用,我们构建了SGK1过表达的腺相关病毒,然后采用OVX的模型及海马立体定位注射病毒载体的方式,探讨SGK1是否能够逆转雌激素缺乏导致的小鼠学习记忆行为下降;利用WB和qPCR验证了病毒有效性,用Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆行为的变化。3.为了探讨SGK1在雌激素调控小鼠学习记忆中的机制,我们利用上述模型,通过Western blot技术(WB)检测了小鼠海马突触相关蛋白(PSD95、GluR1、Spinophilin和Synaptophysin)和actin细胞骨架聚合调节蛋白(Profilin和Cofilin)的表达变化,用高尔基镀银染色和透射电镜检测了海马CA1区树突棘密度及突触密度的变化。4.为了探讨SGK1对雌激素缺乏小鼠AD病理的影响,我们用WB检测了小鼠海马特异性过表达SGK1对Aβ与Aβ代谢相关蛋白表达变化的影响,用刚果红染色和免疫组化染色分别检测了海马老年斑的形成和Aβ沉积的差异。5.为了探讨SGK1在GPR30/mTORC2通路调控小鼠海马突触可塑性和学习记忆中的作用,我们结合体内和体外实验,利用行为学、WB和免疫荧光技术检测了GPR30/mTORC2通路对小鼠学习记忆行为的调控及与SGK1表达之间的关系。主要实验结果:1.转录组芯片结果发现在p<0.05、fc>1.5时,OVX/Sham筛选出143个差异基因,LET/DMSO筛选出136个差异基因。其中,OVX和LET均可引起Gm10717、Gm11116表达上调以及SGK1、Nfkbia表达下调。SGK1在Genemania功能预测上与雌激素受体相关,强烈提示其可能参与了雌激素对小鼠空间学习记忆行为的调控。2.与假手术组相比,OVX导致小鼠在前五天的定位训练实验中找到平台的逃避潜伏期明显延长、在第六天的空间记忆检测实验中通过平台次数和第三象限停留时间均显著减少;而OVX小鼠海马注射过表达SGK1的AAV后前五天逃避潜伏期缩短、第六天通过平台次数和第三象限停留时间显著增加,基本上恢复到假手术动物水平。3.海马特异性过表达SGK1可以逆转OVX导致的突触相关蛋白、骨架相关蛋白表达改变以及CA1区突触密度和树突棘密度降低。4.海马过表达SGK1可以逆转OVX导致的Aβ及其代谢相关蛋白表达的变化、降低BACE1的水平并提高IDE的表达水平,但对Aβ沉积和老年斑的产生无影响。5.GPR30失活可抑制E2诱导的mTORC2、SGK1、突触蛋白和actin聚合等改变;活化mTORC2可逆转GPR30失活诱导的空间记忆损伤和肌动蛋白解聚,而抑制Rictor则可降低SGK1的表达水平。主要结论:1.OVX和LET均可导致海马多个基因表达的显著变化,SGK1是最显著下调的基因之一,生物信息学表明它是和雌激素受体相关的基因,表明SGK1在雌激素调节海马的结构和功能中发挥了重要作用。2.海马过表达SGK1可改善OVX小鼠的突触可塑性、抑制Aβ的生成同时促进其代谢,从而在雌激素调节空间学习记忆过程中发挥关键作用。3.SGK1可能参与了GPR30/mTORC2通路对小鼠海马突触可塑性和学习记忆的调节。4.以上研究结果为阐明雌激素调节学习记忆和认知的机制提供了新的实验证据,为AD的预防和治疗提供了潜在的靶点。