乳腺癌作为女性最常见的肿瘤，越来越严重地威胁到全球女性的健康，其发病率已位于女性恶性肿瘤发病率的首位。2008年全球有138万乳腺癌新发病例，约占女性所有恶性肿瘤发病的23%。据统计，大约一半的新发病例和60%的死亡病例都来自于发展中国家。虽然我国仍属于乳腺癌低发国家，但近年来其发病率以每年3-5%的速度递增，且发病年龄呈现年轻化的趋势。因此，如何识别高危人群，针对性地开展“三早预防”，降低乳腺癌的发病率和死亡率是当前面临的重要挑战。目前普遍认为乳腺癌的发生发展是遗传与环境因素共同作用的结果，而遗传背景的差异可能影响个体在相同暴露因素下对乳腺癌的易感性。迄今为止，乳腺癌遗传易感性的研究已经发现了一些与其发生发展密切相关的基因，比如经典的BRCA1/BRCA2抑癌基因，雌激素代谢酶相关基因（CYP1A1）以及细胞周期调控相关基因（CyclinD1）等，另外全基因组关联研究（GWAS）作为研究复杂疾病强有力的工具，近些年来也先后发现了1p11，2q35，5p12，10q26等多个乳腺癌易感区域。但是，过去乳腺癌遗传易感性的研究多集中在编码基因上，对于非编码基因的研究甚少。近年来，一种非编码的小分子RNA——mircoRNA越来越被研究者关注。MicroRNA（miRNA）是一类长度为18-25个核苷酸的非编码小分子RNA，首先由细胞核内编码miRNA的基因转录形成初级miRNA（pri-miRNA），长度为几百到几千个核苷酸，随后pri-miRNA被核内的核酸酶Drosha加工成长约70个核苷酸长度的发夹状前体miRNA（pre-miRNA），再在转运蛋白的作用下被运输到细胞质中，进一步被Dicer核酸酶处理成成熟的miRNA。在整个miRNA成熟过程中涉及到多个基因，这些基因共同作用影响miRNA的最终形成，而miRNA的正常形成则是miRNA发挥调控作用的必要条件之一。发生在这些通路基因上的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）可能会导致miRNA的成熟不良，而miRNA的整体成熟受限则可以导致细胞的恶性转化。2010年11月，Liang等报道了发生在8个miRNA合成通路基因上的13个SNPs与高加索人群发生卵巢癌的易感性相关。同年，Lin等人发现该合成通路中GEMIN4基因上的rs7813和rs910925可以增加欧美人群肾细胞肿瘤的发病风险和死亡风险。但是，在中国人群中对于miRNA合成通路基因与乳腺癌易感性的关联研究还未见报道，因此，研究miRNA合成通路基因多态与乳腺癌易感性的关系对我国乳腺癌的诊治现状必然是一次有力的推动。截止2011年11月，已发现的人类成熟miRNA达1921个，单个miRNA可以有成百个靶基因，它们参与了细胞的生长、分化以及细胞周期调控等多个环节，据估计miRNAs参与了大概30%以上人类蛋白质的表达，形成了一个庞大的调控网络。乳腺癌的形成和进展中主要包括癌肿转移、逃避细胞凋亡、无限制的细胞分裂、产生药物抗性等机制，其中涉及到一系列相应基因的调控改变，miRNAs在这些过程中与致癌靶基因或抑癌靶基因的相互作用共同影响了乳腺癌的发生发展。比如miR-27b在乳腺癌组织中表达量下降，使得靶基因CYP1B1的表达上调，从而加快了雌二醇的代谢，促进了雌激素受体依赖型乳腺癌的发生。而MUC1的异常表达则可以增加乳腺癌的侵袭和转移能力，miR-145对其负性调控可以抑制MUCI的表达，遏制了乳腺癌的进展。由于成熟的单链miRNA是通过与靶基因3’UTR（3’untranslated regions）的不完全互补配对导致靶基因信使RNA的降解或者翻译抑制，而发生在miRNA靶位点上的一些遗传变异则可能会影响miRNA与靶基因的结合效能，导致miRNA对其调控作用发生改变，特别是对肿瘤发展过程中重要基因的调控，因此我们推测miRNA靶位点上的多态性可能会影响中国女性人群乳腺癌的易感性。综上所述，本课题采用两阶段的病例对照研究，联合多个公共数据库资源筛选相关的功能性SNP位点，探讨miRNA合成通路基因和靶位点的多态性与江苏汉族女性人群乳腺癌易感性之间的关联，并运用功能学实验进一步阐述这些位点的生物学意义，以期发现中国人群乳腺癌遗传易感标志物，从而为高危人群的筛检和乳腺癌的早期诊断和早期治疗等提供科学依据。第一部分MicroRNA合成通路基因多态性与乳腺癌易感性的关联研究【目的】MiRNA合成通路主要包括DROSHA, DGCR8, XPO5, RAN, DICER, TRBP,AGO1, AGO2, GEMIN3, GEMIN4和HIWI这11个基因，这些基因上的遗传变异可能会影响成熟miRNA的形成，从而影响miRNA发挥正常的调控作用，导致乳腺癌的发生。本研究旨在系统探讨miRNA合成通路上相关基因的功能性SNP与江苏汉族女性人群乳腺癌遗传易感性之间的关系。【方法】通过在线软件对miRNA合成通路上11个基因进行功能性SNP筛选，共发现8个基因上24个功能性位点。我们采用TaqMan OpenArray GenotypingSystem平台在878例经病理组织学确诊的乳腺癌新发病例和900例性别年龄与之匹配的健康女性对照中进行基因型检测，对发现的阳性位点在另外914例病例和967例对照中进行进一步验证，并通过双荧光素酶报告基因实验对最终发现的阳性位点进行功能学研究。【结果】Logistic回归分析显示，在调整了年龄、初潮年龄、绝经状态后，位于DGCR8基因3’UTR上的rs417309（G>A）与乳腺癌的发病风险显著相关（第一阶段：调整ORadd=1.46，95%CI=1.04-2.06，P=0.030；第二阶段：调整ORadd=1.59，95%CI=1.09-2.33，P=0.017）。合并两阶段的结果显示，rs417309（G>A）每增加一个突变等位基因A乳腺癌的发病风险平均增加50%（95%CI=1.16-1.93，P=0.002）。分层分析显示在未绝经、ER阳性或者PR阳性的女性中rs417309（G>A）的效应更加显著。为了进一步验证rs417309是否会影响miRNA的结合，我们进行了双荧光素酶报告基因实验，结果显示hsa-mir-579和hsa-mir-106b与rs417309的突变等位基因A结合可以削弱miRNA与DGCR8基因3’UTR的结合能力，从而导致DGCR8表达水平的上调。【结论】位于miRNA合成通路DGCR8基因上的rs417309可能通过影响miRNA的成熟以及miRNA的结合，从而影响乳腺癌的遗传易感性，提示我们位于miRNA合成酶基因上的多态性改变对乳腺癌的早期筛检和预防具有一定的指导意义。第二部分MicroRNA靶位点多态性与乳腺癌易感性的关联研究【目的】miRNA通过作用于相应的靶mRNA，参与了细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程。靶基因3’UTR的遗传变态可能影响miRNA与之结合的能力，从而影响miRNA发挥正常的负性调控作用，引起基因异常表达。本研究旨在探讨与乳腺癌相关的microRNA靶位点多态性与乳腺癌之间易感性的关联。【方法】对2008-2010年PubMed（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）报道的乳腺癌相关miRNA进行筛选，利用网络资源预测这些miRNA的潜在靶位点，对最终入选的24个SNPs在江苏汉族人群中进行两阶段的病例对照研究，第一阶段采用TaqMan OpenArray Genotyping System平台对878例经病理组织学确诊的乳腺癌新发病例和900例性别年龄与之匹配的健康女性对照中进行24个SNPs的基因型检测，第二阶段在914例病例和967例对照中对第一阶段初筛阳性位点进行验证，最后结合双荧光素酶报告基因实验对最终发现的阳性位点进行功能学研究。【结果】在第一阶段的研究中我们发现三个位点（rs10494836, rs10857748,rs7963551）在不同遗传模型中与乳腺癌的发病风险存在统计学关联，其中let-7的靶位点rs7963551(A>C)在第二阶段的验证中仍然保持与第一阶段一致的效应（相加模型：调整OR=0.81，95%CI=0.68-0.97，P=0.024），联合两阶段总样本分析显示，rs7963551的多态性改变显著降低了乳腺癌的发病风险（相加模型:调整OR=0.84,95%CI=0.75-0.95, P=0.007）。分层分析提示该效应在首胎活产年龄小、ER阳性或PR阳性者中更显著。进一步研究基因环境交互作用发现，rs7963551和首胎活产年龄在乳腺癌发病危险中具有显著的交互作用（P=0.041），并且呈现明显的剂量反应关系。与携带rs7963551AA野生纯合子并且首胎活产年龄大于25岁的个体相比，携带CC突变纯合子且首胎活产年龄小的个体发生乳腺癌的风险下降了62%（调整OR=0.38，95%CI=0.24-0.60, P=2.55×10-5）。功能学实验进一步验证了该位点A>C的突变可以削弱let-7与RAD52基因3’UTR端的结合力，从而使得DNA修复基因RAD52的转录水平升高。【结论】Let-7靶位点rs7963551的多态性改变可能与中国人群乳腺癌的遗传易感性有关。