肾癌是一种泌尿外科的常见恶性肿瘤。亚洲国家的发病率明显低于欧美国家。造成这种差异的原因可能是亚洲国家的饮食习惯与欧美国家有很大的不同：亚洲国家的豆制品的消耗量明显较高。我们研究由大豆来源的酪氨酸激酶受体抑制剂genistein对肾肿瘤细胞GRC-1的作用，以确定是否可将酪氨酸激酶受体抑制剂应用于抗肾肿瘤的治疗中，抑制肿瘤细胞的侵袭，并探讨其机理。目的： 肿瘤之所以对人体具有如此之大的危害，就是因为具有侵袭能力。如果能抑制肿瘤细胞的侵袭，辅以必要的外科手段，将有希望治愈肿瘤。酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptor,TKR)信号系统可将细胞外信号传递至细胞内的膜表面受体。多种细胞膜表面受体通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)途径传递细胞信号。生长因子(如表皮生长因子，EGF)受体酪氨酸磷酸化导致膜相关的多种蛋白复合物形成(调节蛋白Shc/Grb2及尿苷酸交换因子Sos等蛋白)，催化GTP分解，激活低分子量GTP结合蛋白Ras。Ras的激活导致丝氨酸苏氨酸蛋白激酶Raft活化，从而导致与MAPK磷酸化和活化有关的几种联级反应蛋白磷酸化，使MAPK活化，引起细胞侵袭相关基因的表达。在本试验中，我们使用酪氨酸激酶抑制剂genistein作用于肾颗粒细胞癌细胞系GRC-1，借助于电镜、流式细胞仪(flow cytometry,FCM)、激光共聚焦显微镜(laser confocal 第四军医大学硕士学位论文 microscope）、局效毛细管电泳仪（blah pe毗rmance papillary ele0rophoresls）、免疫组织化学（immunohistochemistry）等仪器和万 法研究肾肿瘤细胞在酪氨酸激酶抑制剂的作用下生物学活性的变 化，并对其侵袭能力变化的机理进行了研究。为将酪氨酸激酶抑制 剂应用于肾肿瘤的治疗提供了理论依据。 方法： l 应用MTT法研究肾肿瘤细胞在genistein的作用下生长增殖能 力的变化，了解genistein对肾肿瘤细胞的IC川。 2．应用流式细胞仪研究肾肿瘤细胞的细胞周期的变化及此变化与 剂量的关系。 3．使用transwel！小室研究了在genistein作用下肿瘤细胞侵袭能力 的变化。 4．应用活细胞照相、细胞骨架染色、激光共聚焦显微镜、免疫组织 化学技术观察在genistein作用下细胞的大体形态学变化以及细 胞内波形蛋白（vimentin）排列方式的变化。分析在酪氨酸激酶 信号系统被阻断之后，细胞骨架的变化；并分析此种变化与肿瘤 细胞侵袭能力变化之间的关系。 5 应用电子显微镜观察肾肿瘤细胞的超微结构的变化。 6 应用高效毛细管电泳观察genistein对肾肿瘤细胞分泌基质金属 蛋白酶的影响。证明genistein抑制肿瘤细胞的侵袭主要是通过 抑制肿瘤细胞基质金属蛋白酶的分泌。 7．进行了细胞粘附试验以观察genistein对肿瘤细胞粘附能力的影 响。并探讨了肿瘤细胞侵袭能力的变化与粘附能力变化之间的关 系。 结果： 4 第四军医大学硕土学位论文 1．MT T法：gems比h在较低浓度和较短时间内既可明显抑制肿瘤 细胞的增殖。其IC”值在第7天时仅为13umoUI臼．sug／ml人 远低于10 p g／ITil的体内一般药物用药上限。 2．流式细胞仪：在genistein的作用下，GRC刁细胞的分裂明显受 到抑制。肿瘤细胞的增殖停滞在GI／S、GZM期。 3．tfANSWCll小室：在 gCflist6ifl的作用下，GRC八细胞侵袭能力明 显受到抑制。 4 激光共聚焦显微镜、免疫组织化学、细胞骨架染色：在对照组细 胞中，波形蛋白沿细胞核平行分布，呈环形，在细胞核周围形成 “壳状”结构。在胞浆周围呈丝状分布。而在经genistein处理 后，荧光亮度降低，伪足形成减少，细胞变形严重。波形蛋白呈 解聚状态，分布弥散，核周“壳状”结构消失。排布紊乱。 5．电子显微镜：经genistein处理后出现大量凋亡细胞，细胞内溶 酶体减少，内质网扩张，线粒体肿胀，出现大量细胞内囊。细胞 表面微绒毛和细胞间连接减少，残存的细胞间连接变形严重。细 胞核肿胀，核仁膨大，染色质在核内的分布分散。 6．活细胞照相：对照组细胞排布紧密，细胞多为?