组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）对人卵巢癌细胞系A2780细胞周期的影响目的组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACIs）在体外对于多种肿瘤细胞系有抑制增殖、诱导凋亡及分化的作用，且有选择性细胞毒性，与多种现有化疗药物有协同效应，而对正常造血细胞无严重毒性，最近其部分药品已进入Ⅰ／Ⅱ期临床试验。曲古抑菌素A（TSA）源自链霉菌代谢产物，最先作为抗真菌药物使用。近来表明TSA有HDACIs的特征，能通过Zn²⁺螯合作用特异、可逆抑制哺乳动物组蛋白去乙酰辅酶活性，可诱导肿瘤细胞周期阻滞、分化及凋亡。细胞周期素依赖激酶抑制因子（CDKI）P21^WAF／CIPI与细胞周期密切相关，是细胞周期中重要的负调控因子，在肿瘤细胞中低表达或不表达。本实验以人卵巢癌细胞系A2780细胞为靶细胞，通过研究检测细胞周期和P21^WAF／CIPImRNA的表达，探讨TSA对A2780细胞周期的影响及机制。方法1、细胞培养将A2780细胞培养于含10％胎牛血清和100U／ml青、链霉素的RPMI-1640培养基中。孵箱温度为37℃，CO₂浓度为5％，每周传代2—3次。培养细胞用于各项实验研究。2、流式细胞仪检测细胞周期将细胞种于6孔板中，每孔细胞密度为1×10⁵／ml。分别暴露于0、50、100、200、400nM的曲古抑菌素A（TSA），培养24小时。100nM曲古抑菌素A（TSA）作用于细胞6、12、24、36、48小时。用胰酶消化收集每孔细胞。离心管1000rpm、4℃离心5min，5ml PBS冲洗2次，每管加入4ml 75％4℃乙醇，4℃冰箱内固定过夜。1000rpm、4℃离心5min，去乙醇。5ml PBS浸洗5min，离心去上清。碘化丙啶（PI）200μl（100μg／ml），核糖核酸酶A（RNaseA）10μl（10μg／ml），PBS 290μl，4℃避光染色30min，300目筛网过滤后上流式细胞仪检测细胞周期。实验重复3次。3、RT-PCR检测P21^WAF／CIPImRNA将细胞种于培养瓶中，细胞浓度为1×10⁷／ml，一组暴露于0、50、100、200、400nM曲古抑菌素A（TSA），一组暴露于100nM曲古抑菌素A（TSA），分别作用6、12、24、36、48小时，RT-PCR法检测P21^WAF／CIPImRNA的表达水平。实验重复3次。结果100nM曲古抑菌素A（TSA）作用于A2780细胞12小时后，开始出现P21^WAF／CIPImRNA表达水平增高，并随着随时间的增加而升高，于24小时达到顶峰，36小时作用效果与24小时比较相同，48小时作用开始出现下降，G₂／M期细胞增加，S期细胞减少，并随着时间的增加而相应变化，在36小时G₂／M期细胞增加达到顶峰，S期细胞减少到最低，各组间比较有统计学意义（P＜0.05），48小时细胞周期变化与36小时比较无统计学意义。不同浓度的TSA作用A2780细胞24小时，P21^WAF／CIPImRNA表达水平从100nM浓度开始出现升高，与对照组比较有意义（P＜0.05），并随着浓度增加而升高（P＜0.05），从100nM浓度开始G₂／M期细胞增加，S期细胞减少，并随着浓度的增加而变化（P＜0.05）。结论结论本实验研究了曲古抑菌素A（TSA）对A2780细胞周期的影响和作用机制。TSA通过增加P21^WAF／CIPImRNA表达，影响细胞周期素依赖的蛋白激酶的活性，使细胞周期阻滞于G₂／M期，抑制A2780细胞增殖。本实验认为TSA起作用的最小浓度是100nM，最少时间是12小时，作用效果呈现时间、剂量依赖。