第一部分RASSF6在人乳腺癌中的甲基化检测及功l机制研究目的：1检测RAS相关结构域家族成员6(Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 6, RASSF6)在人乳腺癌细胞株中及乳腺癌组织中的表达情况；2检测RASSF6启动子CpG岛在人乳腺癌细胞株和人乳腺癌组织中甲基化情况；3验证RASSF6对人乳腺癌细胞增殖,细胞周期,细胞凋亡,细胞迁移侵袭方面的调控作用；4探讨介导RASSF6抑癌作用相关的信号通路改变。方法：1 采用RT-PCR检测RASSF6在人正常组织、人乳腺癌细胞株和人正常乳腺组织中的表达情况；采用Western blot检测RASSF6在人乳腺癌细胞株中的表达情况；采用Real-time PCR检测RASSF6在人乳腺癌组织和癌旁组织中的表达情况；分析Oncomine微阵列芯片数据库中,RASSF6在人乳腺癌正常组织及癌组织中的表达情况。2使用甲基化特异性PCR (Methylation-specific PCR, MSP)检测RASSF6在人乳腺癌细胞株和人乳腺癌组织中的启动子甲基化情况；使用BGS检测#115号乳腺癌样本中RASSF6启动子甲基化情况。3体外实验中,使用平板克隆实验,软琼脂克隆实验,CCK-8实验,EdU掺入实验检测RASSF6对人乳腺癌细胞增殖能力的调控作用。4体内实验中,使用裸鼠成瘤实验验证RASSF6对人乳腺癌细胞增殖能力的调控作用。5采用流式细胞仪检测RASSF6对人乳腺癌细胞的细胞周期的调控作用,并采用Western blot检测RASSF6对p21和p27的调控作用。6采用AO/EB染色和流式细胞仪检测RASSF6对人乳腺癌细胞凋亡的诱导作用,并用Western blot检测cleaved-caspase3, cleaved-caspase7, cleaved-caspase9, cleaved-PARP的变化。7采用划痕实验和Transwell小室检测RASSF6对人乳腺癌细胞迁移能力的调控作用；采用Transwell小室检测RASSF6对人乳腺癌细胞侵袭能力的调控作用；采用Real-time PCR和Western blot检测RASSF6对S100A4,MMP2的调节作用。8采用Western blot检测RASSF6对Akt信号通路的调控作用。结果：1 RASSF6在人正常组织和人正常乳腺组织中广泛表达；而在人乳腺癌细胞株中,多个细胞表达下调或缺失,包括BT549和MDA-MB-231等三阴性乳腺癌细胞株；相对于人乳腺癌旁组织,RASSF6在人乳腺癌组织的表达显著下调。2 RASSF6在BT549和MDA-MB-231细胞株中检测到甲基化,在人乳腺癌组织中检测到广泛甲基化。3体外实验中,平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验显示RASSF6可显著抑制人乳腺癌细胞的克隆形成能力；CCK-8实验和EdU掺入实验显示出RASSF6抑制增殖的能力；体内实验中,RASSF6可显著抑制移植瘤的生长速度。4流式细胞结果显示RASSF6可显著抑制G0/G1期向S期转换,且显著上调p21；AO/EB染色和流式细胞结果显示RASSF6可诱导人乳腺癌凋亡,且caspase3,caspase7,caspase9,PARP发生剪切。5划痕实验和Transwell实验显示RASSF6可显著抑制人乳腺癌细胞的迁移和侵袭,且显著下调S100A4和MMP2的表达。6 Western blot结果显示RASSF6可显著下调Akt的磷酸化水平,而Akt为S100A4和MMP2的上游信号通路.结论：1 RASSF6由于启动子DNA甲基化导致其在人乳腺癌组织中的表达显著下调。2 RASSF6通过抑制Akt信号通路调控人乳腺癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力。第二部分miR-7-5p靶向REGγ抑制人乳腺癌细胞增殖目的：1 验证敲减miR-7-5p对人乳腺癌细胞增殖的调控作用以及对REGγ表达的调节作用。2 验证REGy是否会逆转miR-7-5p抑制人乳腺癌细胞增殖功能。3 体内实验验证miR-7-5p抑制人乳腺癌细胞增殖。方法：1使用瞬时转染miR-7-5p抑制剂抑制miR-7-5p的表达,采用CCK-8实验检测细胞增殖能力以及使用Western blot检测REGy蛋白水平变化；并使用流式细胞仪检测细胞周期改变。2共转染miR-7-5p和REGy,采用CCK-8实验检测细胞增殖能力以及采用流式细胞术检测细胞周期改变。3使用过表达RASSF6的细胞株以及对照细胞株构建裸鼠移植瘤模型；测量移植瘤的体积和重量；且使用免疫组化检测Ki-67和REGy的变化。4提取Oncomine微阵列芯片数据验证在同样的乳腺癌组织中miR-7-5p和REGy之间的相关性。结果：1 敲减miR-7-5p可促进人乳腺癌细胞的增殖能力,促进G0/G1期向S期转化,且REGy蛋白水平有显著上调。2 REGy可部分逆转miR-7-5p的抑增殖功能,细胞周期结果显示出相同的变化。3移植瘤构建成功,miR-7-5p可显著抑制移植瘤的生长；移植瘤切片显示增殖相关基因Ki-67显著下调及REGy蛋白水平显著下调。结论：1 miR-7-5p可通过靶向REGy抑制人乳腺癌细胞的增殖,REGy为miR-7-5p下游靶基因。