金龟子属鞘翅目昆虫，是农林牧业生产中一类重要的土栖害虫。暗黑鳃金龟（Holotrichiaparallela）为我国金龟子优势种，其幼虫蛴螬危害花生、大豆、地瓜、玉米、草坪、花卉、蔬菜等多种作物，常造成巨大的经济损失。由于长期依赖化学农药防治，不仅使暗黑鳃金龟抗药性不断增强，同时也明显削弱了自然天敌的控制能力。随着人类环保意识的增强，对害虫的防治措施有了新的要求，不仅要有效控制害虫，还要保证对人畜和其赖以生存的环境的安全。近年来，国内外专家学者将注意力转向了昆虫的行为调控，利用天然的或其自身的化学通讯物质——信息素，研制引诱剂用于防治害虫。行为调控是一种新型的治虫技术，引诱剂不与作物直接接触，专一性极强，与化学农药相比，不会产生高残留、污染环境、害虫再猖獗及抗药性等问题。探讨昆虫感受气味分子的机制，可对开发高效行为调控剂提供重要的知识积累。本文针对金龟子的防治现状，以暗黑鳃金龟为试虫，重点对参与暗黑鳃金龟气味感受的气味结合蛋白(OBP)及其功能，以及引诱物的田间引诱效果进行了研究，主要结果如下:　　1暗黑鳃金龟气味结合蛋白基因的克隆、序列分析和表达谱研究　　通过RACE技术获得暗黑鳃金龟HparOBP1和HparOBP2全长cDNA，Genbank登录号分别为GQ395804和JF422903。对HparOBPs分析发现，HparOBP1和HparOBP2具有典型的昆虫OBP结构特征:含有保守的6个半胱氨酸位点和信号肽序列，且第2和第3个半胱氨酸间隔3个氨基酸、第5和第6个半胱氨酸间隔8个氨基酸。通过HparOBP1和HparOBP2氨基酸序列相似性分析，发现两者相似性仅有14.6％。将暗黑鳃金龟HparOBPs氨基酸序列与其他几种昆虫OBPs的氨基酸序列比较，结果显示HparOBP1较HparOBP2相对保守，HparOBP1和HparOBP2分别与大黑鳃金龟HoblOBPl(ACX32050)(83％)和HoblOBP2(ACX32049)(78％)的相似度最高。对HparOBP1和HparOBP2进行系统发育进化分析，结果显示HparOBP1和HparOBP2明显的被分到两个簇中，但两者都与大黑鳃金龟有较高的相似性。以半定量PCR对HparOBPs进行组织表达谱分析，研究结果发现，HparOBP1和HparOBP2在雌雄触角中均有高表达，在其他组织中无明显表达。上述结果暗示，HparOBP1和HparOBP2与暗黑鳃金龟的求偶和觅食行为相关。　　2暗黑鳃金龟气味结合蛋白HparOBP1和HparOBP2的功能研究　　为确定上述HparOBPs基因的功能，利用带有酶切位点的特异引物，将PCR扩增产物克隆到带有相同酶切位点的pET-30a(+)原核表达载体，构建pET-HparOBPs重组表达载体。37℃下，利用0.2mMIPTG诱导HparOBPs在大肠杆菌异源表达系统中过表达，诱导培养时间为4h。SDS-PAGE电泳分析菌液粗提物，显示HparOBP1以包涵体形式存在，HparOBP2则是可溶性蛋白。利用两者携带的His标签亲和特性，通过镍柱亲和层析得到纯度较高且具高活性的重组蛋白。采用荧光竞争结合实验的方法对HparOBPs重组蛋白与不同气味分子的亲和力进行了测定。11种气味分子配基（其中2种性信息素物质和8种暗黑鳃金龟寄主植物挥发物质或次生物）中有9种小分子物质可以与HparOBP1和HparOBP2相结合。其中法尼醇(Farnesol)，月桂酸(lauricacid)，异亮氨酸甲酯(LIME，主要信息素物质)，反式-2-己烯-1-醇(E-2-hexen-1-ol)，柠檬烯(limonene)和α-蒎烯(α-pinene)只与HparOBP1相结合，解离常数分别为4.1，5.2，10.6，10.7，11.0，16.8。苯甲醛(Benzaldehyde)和芳樟醇(linalool，次要信息素物质)只与HparOBP2结合，解离常数分别为12.9and18.8。3-己烯-1-醇(3-hexen-1-ol，acetate)与HparOBP1和HparOBP2两者都有结合活性，且结合活性相似，分别为30.0和29.5。以上结果表明HparOBP1和HparOBP2在暗黑鳃金龟求偶和觅食中起到重要作用。　　3暗黑鳃金龟对生物引诱剂的趋向反应及田间应用研究　　选取可与HparOBP1和HparOBP2结合的性信息素物质和植物源气味分子及其衍生物，进行室内电生理和田间试验，以寻找和确定暗黑鳃金龟性诱剂和植物诱剂的实际田间引诱效果。在植物诱剂研究方面，不同寄主植物叶片对雌虫的引诱作用差异较显著，雌雄虫分别对榆树和桑树表现出较强的趋向反应。实验选取了15种植物源气味分子对暗黑鳃金龟进行EAG反应测试，结果显示15种气味分子均能引起暗黑鳃金龟触角的EAG反应，但反应强弱各异。雄虫触角对苯甲醛和α-蒎烯的EAG反应值显著高于其他气味分子，分别为2.63±0.14和2.54±0.12;雌虫触角对气味分子罗勒烯的EAG反应值最高，为1.76±0.09。选取对雌雄虫有较高EAG反应的9种物质进行田间引诱实验，就诱虫总量而言，α-蒎烯对雌雄虫的引诱效果相对好于其他气味分子，其次为顺-2-己烯-1-醇;就诱虫性别而言，诱芯诱到的雄虫数量均大于诱到雌虫的数量;但不同气味对暗黑鳃金龟雌、雄虫诱虫量和诱虫总量均无显著性差异。两种引诱物质的确定为暗黑鳃金龟食诱剂的研制和开发奠定了基础。　　在山东青岛、辽宁锦州、河北保定、河南开封、山东临沂、安徽蚌埠、江苏如皋、泰兴、湖北襄樊8个地方开展了暗黑鳃金龟性诱剂田间试验。本试验所采用的诱芯及诱捕器对暗黑鳃金龟成虫的诱捕效果明显。其中襄樊市在全部性诱剂防治的试点中保果效果和防虫效果最好，宜城和襄阳两个试点的保果效果分别为66.0％和68.6％，幼虫减退率分别为78.8％和75.0％，同时发现此地区每日诱虫量并无明显大小日现象，不符合暗黑鳃金龟隔日出土特性，这一特性或存在地域性。暗黑鳃金龟性诱剂在全国多地的田间试验结果为其大面积推广提供了技术支持。　　4暗黑鳃金龟转录组文库的Solexa测序及OBP基因和CSP基因的组织表达谱分析　　为寻找更多的功能性OBPs，利用Solexa高通量测序技术对暗黑鳃金龟转录组进行了测序。测序所得数据产量碱基数约合4.5G，共得到Unigenes43，967条。利用GO数据库分析数据显示共有21，512个预测蛋白匹配149，270项GOterms。所有Unigenes中，58，834条Unigenes参与11类细胞组分的构成，60，054条Unigenes归入25类分子功能项中，74，988条Unigenesto参与21类生物学过程。根据Unigenes和COG数据库的比对结果发现，其中共有19，992个Unigenes比对上该数据库，这些Unigenes所表达的蛋白涉及26个不同的功能分类，最多数量的Unigenes比对到了COG数据库的一般代谢这一功能项（8，091条），比对到细胞运动性(116条)和辅酶的转运和代谢(223条)两功能项的Unigenes数最少。KEGG代谢通路分析显示，共有4，849个蛋白获得了KOnumber，这些蛋白共参与37条代谢途径，与暗黑鳃金龟气味识别和运输相关的代谢涉及到信号分子互作、信号转导以及膜运输。　　通过对暗黑鳃金龟转录组蛋白序列的特异搜寻，共找到了25个全长HparOBPs基因和16个全长HparCSPs基因。共有20个HparOBPs基因和13个HparCSPs基因验证成功。HparOBPs序列分化较大，氨基酸个数从113到223不等，半胱氨酸个数最高可达13个。25个HparOBPs中含有2个HparPBPs，3个HparASPs，1个HparGOBP和19个HparOBPs。16个HparCSPs的氨基酸数从375bp-408bp不等。氨基酸比对显示HparCSPs具有保守的Four-cysteinemotif。半定量结果显示，9个HparOBPs基因是触角特异表达的，分别为HparOBP1、parOBP2、parOBP3、parOBP4、HparOBP9、HparOBP17、HparOBP18、HparASP1和HparPBP1;HparCSP1、HparCSP7和HparCSP12仅在触角中表达;其中HparOBP17和HparCSP7为雄虫触角特异表达。暗黑鳃金龟转录组的生物信息学分析进一步丰富了其化学通讯方面的研究内容。HparOBPs和HparCSPs基因表达特征的研究，尤其是触角特异表达的基因，为HparOBPs和HparCSPs的后续功能研究提供了很好的依据。