研究背景和目的 粘膜损伤是十二指肠炎、Crohn病、溃疡性结肠炎等肠道疾病的主要病理改变。脾气虚弱证是这些疾病中较常见的证型之一。益气健脾是中医治疗脾气虚弱证的根本法则。党参、黄芪、白术、甘草是常用的益气健脾中药，由其组成的方剂如四君子汤和补中益气汤等在临床上治疗慢性胃炎、消化性溃疡、克隆氏病和慢性结肠炎等胃肠道疾病具有较明确的疗效。药理学研究也证实，它们对各种原因引起的胃肠粘膜损伤具有防治作用。 目前有关益气健脾方药胃肠粘膜修复的细胞分子生物学机理及其作用的物质基础还未阐明，现有的文献多为益气健脾中药对胃粘膜和结肠粘膜保护的研究方面，而对小肠粘膜作用的研究尚为空白。我们认为益气健脾方药小肠粘膜修复作用可能与其影响小肠隐窝细胞增殖、分化和移行的调控有关。隐窝细胞是位于小肠腺体隐窝区内的原位定向干细胞，具有未分化特性和增殖潜能，在粘膜损伤的情况下，隐窝细胞加速增殖，并转变成为分化细胞，快速移行到上皮表面，覆盖损伤粘膜，以维持小肠粘膜的完整性。小肠隐窝细胞增殖、分化和移行在粘膜修复过程中起着关键作用，其调节机制非常复杂，已知鸟氨酸脱羧酶(ODC)及其催化产物多胺参与了多种肽类物质如胃肠激素、原癌基因、生长因子相关基因和细胞因子等的表达，从而促进隐窝细胞增殖、分化和移行，在小肠粘膜修复过程中发挥重要作用。 小肠隐窝细胞株(IEC-6)是Quaroni等从大鼠小肠隐窝细胞分离出来并经体外培养传代而建立的。在组织学和免疫学方面与增殖性隐窝细胞无明显差别，具有未分化特性，在合适条件下，能分化为成熟的肠细胞。IEC-6的建立对于研究小肠粘膜及上皮细胞的生理、病理和药物作用等具有重要意义，为研究细胞增殖和移行提供了合适的体外模型。自建株以来被国外学者广泛运用于小肠粘膜修复的细胞和分子机理的研究。 根据以上研究背景，提出如下工作假说：益气健脾类中药粘膜修复作用的可能机制是通过影响小肠隐窝细胞ODC基因转录、蛋白表达及其活性，进而影响细胞内多胺的生物合成，促进隐窝细胞的增殖、分化和移行而实现的。围绕这一假设，本项目选择IEC-6作为实验对象，以益气健脾代表药物党参、黄芪、白术、甘草的有效组分对IEC-6细胞增殖、分化和移行，以及对细胞内ODC和多胺的作 张子理：益气健脾中药小肠隐窝干细胞分子药理研究用为指标进行活性追踪，确定单味药的有效部位和有效成分，并在明确有效成分的基础上进行适当的化学配伍，观察其对小肠粘膜修复的关键细胞酶即ODC基因转录、ODC蛋白表达和 ODC活性，以及对多胺合成的影响，归纳出益气健脾中药中与小肠粘膜修复相关的主要有效组分及其组合规律，明确其作用特点和物质基础，阐明益气健脾中药对肠粘膜修复作用的分子生物学机制，同时为益气健脾药物治疗疾病提供现代药理学依据，对“益气健脾”的科学内涵有所认识。研究方法1 细胞培养 IEC6细胞（ 3代）到货后立即复苏。细胞在3 7 oC水浴中迅速解冻，70％酒精消毒，转入含扣·L‘胎牛血清，10mg·L‘胰岛素和 50mp·L‘庆大霉素的DMEM培养液（cDmM）中，在900空气loCO。的潮湿环境中，37℃条件下培养。5天传代 1次，每周换液 3次。第 18－23代细胞用于实验。二 WC－6细胞药理实验技术方法的建立 通过观察细胞接种密度和培养时间对IEC6细胞增殖的影响，以及胃泌素和DFMO对 hC七细胞增殖、分化、移行及 ODC和腐胺含量的作用，建立 IEC6细胞药理实验方法。3 益气健脾中药对WC．6细胞药理作用筛选3．1 细胞增殖活性的检测：噬哩蓝比色（MTT）法 iC－6细胞以每孔 IX 10’／200pL的密度接种于 96了培养板，24h后加人实验药物，空白组加等量 D皿S，每组设 3个复孔。加药后 24h，加入 sg·L” MTT溶液20pL，继续孵育 4h，每孔吸去上清 120pL，加入 2009·LJ SDS溶液 120PL，振荡15min，室温过夜，次日用酶标仪检测570urn处的光吸收值（OD人计算细胞增殖率。 空白组OD一实验组OD 细胞增殖率一门—一）XI 00％ 空白组OD3．2 IEC乃细胞分化的观察 6孔培养板每孔加 1滴cDNffiM，放置盖玻片使其与培养板底部粘贴牢固，以让细胞爬上盖玻片。接种阻C币细胞，密度为每孔ZX m‘o000pL，培养24h，加入实验药物，空白组加等量 DIBS，每组设 3个复孔。24h后取出盖玻片，100ml·L”‘福尔马林固定20ndn，HE染色，显微镜观察细胞分化的形态特征。3．3 IEC币细胞移行的观察 IEC6细胞以每孔 2 X106／2000pL的密度接种于 6孔培养板，接种后第 72h， 2 广州中医药大学2002届博士学位论文用18mm长的单面刀片轻刮单细胞层，产生约18minXS～10mm的损伤区，立即更换培养液，并加入实验药物，空白组加等量 DPB S，每组设 3个复孔。加药后 24，48和 72h倒置显微镜下放大