论文部分内容阅读
目的：探讨DNMT1mRNA在SLE患者与正常人CD4+T淋巴细胞中的表达及与自身免疫反应的关系。方法：采用Real time RT-PCR方法检测30例SLE患者与18例正常人CD4+T淋巴细胞DNMT1的mRNA表达水平,同时检测细胞基因组DNA总体甲基化水平,分析二者之间的相关性及其与疾病活动性评分(SLEDAI)的相关性。结果：与正常人比较,SLE患者CD4+T淋巴细胞的DNMT1mRNA表达水平明显降低(P<0.05),细胞基因组DNA总体甲基化水平显著降低(P<0.05),SLE患者CD4+T淋巴细胞的DNMT1mRNA的表达水平与细胞基因组DNA总体甲基化水平呈显著正相关(r=0.476,P<0.01),细胞基因组DNA总体甲基化水平与SLE-DAI成负相关(r=-0.45,P<0.05),而SLE患者DNMT1mRNA的表达水平与SLE-DAI的相关性不明显(r=-0.196,P>0.05)。结论：SLE患者CD4+T淋巴细胞的DNMT1mRNA表达水平的下降,且DNA低甲基化关联,在SLE发病机制中起重要作用。目的：构建重组人DNMT1慢病毒载体并进行包装。方法：人DNMT1基因片段经PCR扩增后,与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,获得pLenti6.3/V5-DNMT1表达质粒,转化细菌感受态细胞,克隆菌落行PCR鉴定,对阳性的重组质粒进行测序；将重组质粒与慢病毒包装系统同转染293FT细胞进行病毒包装,Real time定量PCR法检测病毒滴度。结果：DNA测序结果证实成功构建人DNMT1重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为3.13*1010copies/ml。结论：成功构建并包装人DNMT1重组慢病毒表达载体。目的：体外研究pLenti6.3/V5-DNMT1质粒对SLE患者外周血CD4+T淋巴细胞的作用。方法：将pLenti6.3/V5-DNMT1质粒和pLenti6.3/V5-GW/LacZ(对照质粒)分别侵染SLE患者外周血CD4+T淋巴细胞,运用qPCR, Western blotting,流式细胞仪和ELISA分别检测SLE患者外周血CD4+T淋巴细胞的DNMT1基因表达,DNMT1蛋白水平,细胞基因组DNA总体甲基化状态和IgG抗体产量。结果：转染pLenti6.3/V5-DNMT1质粒后, SLE患者外周血CD4+T淋巴细胞的DNMT1基因表达水平明显提高,DNMT1蛋白水平明显增加,细胞基因组DNA总体甲基化状态提升并减少IgG抗体的产生。结论：过表达DNMT1能逆转SLE患者CD4+T细胞的异常低甲基化作用,抑制自身免疫反应。