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血管性痴呆(Vasculardementia,VaD)是最常见的非变性病痴呆,目前是仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)第二大痴呆疾病[1]。目前VaD诊断不足、缺乏有效治疗方案,人均预期寿命延长以及高血压、冠心病、糖尿病、代谢综合征和脑卒中等危险因素使VaD患者人数持续上升。但VaD是可以防治的痴呆类型,具有可逆、早期干预预后较好的特点,因此迫切需要开发有效的诊断方法和药物进行诊断指导和治疗。研究表明,脑缺氧缺血引起的白质损伤是VaD的重要病理变化,脑白质的弥漫性改变伴髓鞘和轴突的丢失几乎是所有VaD亚型的共同特征,白质损伤与VaD认知能力下降密切相关,但目前其神经生物学机制尚不明确。参麻益智方是全国名老中医周文泉教授的经验方,以人参、天麻、鬼箭羽、川芎四味中药配伍,临床常用于治疗气虚血瘀阳亢型VaD,并取得了良好疗效,基于此,本实验通过研究参麻益智方对血管性痴呆模型大鼠白质损伤的影响及作用机制,以明确该方对VaD脑缺血缺氧后的白质病变是否有改善作用,本文同时也对VaD的白质损伤与血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)破坏、氧化应激的相互关系进行了探讨,以期为探索有效的认知功能保护策略提供帮助。目的:观察参麻益智方对血管性痴呆大鼠白质的影响,并对参麻益智方的作用机制及其与血脑屏障通透性、氧化应激的相关性进行探讨。方法:1.采用聚苯乙烯微球栓塞法建立大鼠多发脑梗死痴呆模型,将56只雄性Wistar大鼠,随机分为空白组(Control)、假手术组(Sham)、模型组(Model)、多奈哌齐组(Donepezil)、参麻益智方低剂量组(SMYZ-L)、中剂量组(SMYZ-M)、高剂量组(SMYZ-H)。造模结束3天后,多奈哌齐组予0.5mg/kg药物灌胃,参麻益智方低、中和高剂量组分别予3.3g/kg、6.6g/kg及16.5g/kg药物灌胃,假手术组、模型组予等量蒸馏水灌胃。2.连续4周给药后,采用Morris水迷宫观测血管性痴呆大鼠的逃避潜伏期、穿台次数、原平台活动时间及路程的结果,评估大鼠空间学习记忆能力;采用苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)、尼氏染色(Nissl)评估大鼠海马CA1区神经元形态学和尼氏小体的病理变化。3.卢卡斯快蓝染色(Luxol fast blue,LFB)观察胼胝体区髓鞘形态、免疫印迹法(Western blot,WB)检测脑白质髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)以评估髓鞘脱失情况。WB检测海马组织内紧密连接蛋白Occludin、ZO-1,缝隙连接CX43的蛋白表达,评估BBB功能。比色法检测海马组织过氧化氢酶(Catalase Micrococcus lysodeikticus,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的活性,微量还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、细胞丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量,评估氧化应激水平。结果:1.行为学检测定位航行实验:同一天组间比较:与Sham组相比,Model组的潜伏期第二天开始明显高于Sham组,组间相比差异具有统计学意义(P<0.05);提示多发梗死性VaD模型的Model组大鼠学习能力明显下降;与Model组比较,Donepezil组潜伏期第二天开始明显缩短(P<0.05),SMYZ-M、SMYZ-H组在第三天开始明显缩短(P<0.05)。组内比较:与组内第一天比较,所有组大鼠的潜伏期均有缩短,其中Control组、Model组在第二天开始潜伏期均明显缩短(P<0.05),Donepezil组和SMYZ-L、SMYZ-M、SMYZ-H组在训练第三天的潜伏期也明显缩短(P<0.05)。空间探索实验:与Control组相比,Sham组差异无统计学意义;与Sham组比较,Model组穿台次数减少,第一象限时间与路程降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,SMYZ-L、SMYZ-H组的大鼠穿台次数显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05);Donepezil组和SMYZ-M组第一象限活动路程增加,差异有统计学意义(P<0.05)。2.脑组织病理形态光学显微镜下观察大鼠海马CA1区的病理形态变化。可见Control及Sham组细胞层次分明,排列整齐有序,细胞形态规则,尼氏体丰富,呈深蓝色的颗粒或斑块状:Model组与Control组相比,大鼠海马CA1区细胞间隙增大,排列散乱无序,细胞形态不规则,尼氏体崩解或丢失,颜色变浅且分布散乱;与Model组大鼠对比,Donepezil、SMYZ-L、SMYZ-M和SMYZ-H组海马CA1区细胞层数增加,排列较为紧密,病理形态均有不同程度改善,胞浆内可见较多尼氏体,丢失不明显。3.胼胝体髓鞘形态和蛋白表达LFB染色可观察到,Control组大鼠胼胝体区髓鞘呈深蓝色,髓鞘染色呈条索状、髓鞘纤维排列致密;与Control组比较,Sham组髓鞘纤维排列稍散乱,髓鞘着色未变浅;Model组大鼠与Control组比较,胼胝体髓鞘着色变浅、结构疏松、胼胝体(Corpus callosum,CC)区域视野下数量较少。Donepezil及SMYZ干预后胼胝体区域髓鞘颜色变深,结构较紧密。WB结果显示,与Control组相比,Sham组的MBP表达量无统计学差异(P>0.05),Model组海马组织中MBP的表达量明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05);与Model组相比,Donepezil组和SMYZ-H组的MBP明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05),SMYZ-L、SMYZ-M组具有改善作用,但差异无统计学意义。4.BBB相关蛋白表达WB结果显示与Sham组相比,Model组大鼠脑海马组织中Occludin、ZO-1的表达明显减少,Model组与Sham组相比差异有统计学意义(P<0.05)。Donepezil和 SMYZ 干预可增加 Occludin、ZO-1 的表达,其中 Donepezil、SMYZ-H组与Model组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。与Sham组相比,Model组大鼠CX43表达明显增多(P<0.05),SMYZ-M、SMYZ-H组干预可明显减少CX43的表达,与Model组相比差异具有统计学意义(P<0.05);Donepezil组和SMYZ-L组也可一定程度减少CX43的表达,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。5.氧化应激水平比色法结果显示,与Control组相比,Sham组CAT、GSH、SOD的活性及MDA含量无统计学差异(P>0.05)。与Sham组相比,Model组CAT、GSH、SOD活性明显下降,且MDA含量明显升高,组间相比差异具有统计学意义(P<0.05)。与Model组相比,Donepezil、SMYZ-H组CAT活性明显升高(P<0.05),SMYZ-L、M组CAT活性相比于Model组具有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);SMYZ-M和SMYZ-H组的GSH活性明显升高(P<0.05);SMYZ-M、SMYZ-H 组 SOD 的活性明显增高(P<0.05),Donepezil与 SMYZ-L组SOD活性相比于Model组具有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);Donepezil、SMYZ-M、SMYZ-H组MDA含量明显降低,与Model组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:一、参麻益智方可明显提高血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力,一定程度改善组织细胞病理形态学特征,具有神经保护作用;二、参麻益智方可增加MBP表达,改善胼胝体髓鞘形态,具有脑白质保护作用;三、可降低屏障通透性,改善BBB功能障碍;四、可增强神经细胞清除自由基和活性氧的能力,减轻氧化应激损伤。五、其改善白质的作用机制可能与以下两个方面有关:(1)改善紧密连接和缝隙连接蛋白功能,保护屏障完整性而减轻BBB功能障碍,阻止炎性因子和血浆内有害物质渗漏入脑而改善神经细胞内环境、减少细胞凋亡,从而减轻白质损伤。(2)增强神经细胞清除自由基和活性氧的能力,缓解神经血管单元功能失调,减轻活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)介导的神经元损伤、细胞能量代谢障碍,减轻脑深部白质微血管损害,从而减缓白质梗死的形成。参麻益智方改善白质损伤的作用机制作为减轻或预防VaD的新型神经保护方法的重点,具有潜在的可行性和应用价值。