腺病毒介导的URG11RNAi抑制肝癌细胞生长及机制研究

来源 :第四军医大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:zhoubo1204
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URG11是利用抑制消减杂交及全长PCR扩增技术(RACE-PCR)克隆的一个可以被乙肝病毒X蛋白上调的新基因,编码70KD蛋白质。该蛋白含有2个VWFC结构域及一个C型凝集素结构域。VWFC结构域与细胞黏附、迁移、淋巴细胞的归巢及信号转导密切相关,而C型凝集素结构域参与细胞的增殖、分化。前期研究表明,URG11在肝癌等恶性肿瘤中高表达,并与肿瘤恶性程度相关。URG11还可促进肿瘤细胞增殖、分化,增强软琼脂克隆形成能力及癌细胞裸鼠体内成瘤能力,及通过上调β-桥连蛋白(β-catenin)的表达促进肿瘤细胞体外移动、黏附。另发现,它可增加细胞内游离钙离子浓度。因此,URG11是一个和肿瘤恶性生物学行为密切相关并具有重要功能的新基因,但是否可作为肝癌治疗,尤其腺病毒介导的基因治疗新靶点,有待进一步阐明。【目的】利用URG11及URG11-SiRNA腺病毒进行肝癌基因治疗实验,阐明URG11对肝癌细胞恶性生物学行为的影响,并初步探讨相应的分子机制。【方法】1、构建URG11及URG11-SiRNA腺病毒载体;利用包装的腺病毒感染URG11高表达的人肝癌细胞系HHCC及URG11低表达的QZG细胞系,下调或上调其中URG11蛋白表达水平,利用Western blot方法进行检测;2、采用MTT法绘制感染细胞的生长曲线,流式细胞术检测感染细胞的凋亡及细胞周期分布情况;3、进行裸鼠体内成瘤实验和基因治疗实验,结合体外实验,进一步验证该基因功能;4、进行双向凝胶电泳等实验,筛选URG11促进肝癌细胞生长和转移的上下游分子。【结果】1、URG11及URG11-SiRNA腺病毒包装及鉴定我们应用腺病毒载体购建试剂盒,成功构建并包装了URG11及URG11-SiRNA腺病毒(Ad-CMV、Ad-pi0为阴性对照),应用URG11-SiRNA腺病毒感染肝癌细胞HHCC,经Western Blot实验证实,可以有效降低URG11蛋白的表达水平,为下一步实验奠定基础。2、腺病毒介导的URG11siRNA抑制肝癌细胞体外增殖首先应用Western Blot检测三种肝癌细胞系HHCC、SMMC7721、HepG2及人永生化肝细胞QZG中URG11蛋白表达情况,证实该蛋白在四种细胞均有不同程度表达,其中HHCC表达水平最高,而QZG表达水平最低;URG11-SiRNA腺病毒感染肝癌细胞HHCC后进行MTT实验发现,URG11蛋白表达水平下调明显抑制了肝癌细胞的生长(P<0.05);应用流式细胞术检测感染后细胞凋亡和周期分布的变化,发现下调该基因能够减少细胞G1-S期阻滞并促进凋亡(P<0.05);而URG11腺病毒感染QZG细胞可以促进细胞生长,造成细胞G1-S期阻滞并抑制凋亡(P<0.05)。3、腺病毒介导的URG11siRNA抑制肝癌细胞体内成瘤体内实验显示,用携带URG11-SiRNA的腺病毒与肝癌细胞HHCC细胞混合后注射裸鼠,可以通过下调URG11表达在一定程度上抑制HHCC细胞裸鼠体内成瘤能力;URG11-SiRNA腺病毒直接注入瘤体,可以明显减小肿瘤体积(P<0.05)。4、URG11上下游效应分子的筛选在相似条件下重复进行双向凝胶电泳实验,利用Melanie3 2-D分析软件分析,从蛋白双向电泳图谱中选取稳定差异表达的、大小集中在20kd至100kd之间的19个蛋白质斑点进行切割,经过脱银、蛋白酶消化后,进行飞行质谱检测,得到肽质量指纹图谱。经过软件分析,成功确定了6个差异表达蛋白,为钙离子调节或与肿瘤细胞运动相关的蛋白。其作用机理有待进一步深入研究。【结论】本研究成功构建并包装了URG11及URG11-SiRNA腺病毒,应用病毒进行体内体外实验,在肝癌中证实URG11促进肿瘤生长转移的功能,并进行了肝癌基因治疗的初步尝试。筛选得到一系列与肿瘤细胞生长运动相关的URG11上下游分子,为进一步研究该基因功能奠定基础。
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