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目的：
人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)是从人牙周膜组织中分离培养出来的一种间充质干细胞，该细胞具有较高的成骨活性，是修复牙周骨缺损的最具潜力的细胞之一。大气压常温等离子体(atmospheric room temperature plasma, ARTP)具有消毒灭菌、促进细胞增殖、诱导癌细胞凋亡等多方面的作用，它能够引起生物体体内的ROS发生变化，从而导致相应的生物学效应。本研究拟探寻ARTP对hPDLSCs成骨分化的影响，以及ARTP对胞内ROS的作用与细胞成骨分化之间的关系，从而探明ARTP对hPDLSCs成骨分化的影响及其可能机制。
方法：
(1)组织块法原代培养人牙周膜细胞，并采用有限稀释克隆法分离出hPDLSCs。结晶紫染色法测定hPDLSCs的克隆形成率；CCK-8法测定hPDLSCs的生长曲线；成骨及成脂向诱导检测hPDLSCs的分化潜能；流式细胞术检测hPDLSCs的表面CD90、CD146、CD34和CD45的表达。
(2)使用ARTP处理hPDLSCs，将细胞分为4组：1个空白对照组、3个实验组：ARTP分别处理30s、1min、2min，处理完成后对细胞行成骨诱导培养。碱性磷酸酶检测试剂盒测定成骨诱导培养7d和14d时hPDLSCs的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性；茜素红染色法及半定量分析检测成骨诱导培养21d时hPDLSCs的矿化形成情况；RT-qPCR检测成骨诱导培养3d和7d时hPDLSCs成骨基因的表达情况。
(3)使用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC )预处理hPDLSCs，以清除和抑制胞内ROS的形成，将细胞按如下分组进行处理：(i)空白组，(ii)NAC组，(iii)ARTP处理组，(iv)NAC+ARTP处理组，处理完成后对细胞行成骨诱导培养。处理完成后使用活性氧检测试剂盒检测细胞内的ROS变化；成骨诱导7d和14d，碱性磷酸酶检测试剂盒测定hPDLSCs的ALP活性；成骨诱导21d，茜素红染色法及半定量分析检测hPDLSCs的矿化形成状况；成骨诱导3d和7d，RT-qPCR检测hPDLSCs成骨基因的表达情况。
结果：
(1)原代培养的hPDLSCs呈梭形、三角形、多边形，其克隆形成率约为44%；生长曲线呈“S”形；细胞可成骨及成脂向分化；流式检测结果显示：CD90(+)、CD146(+)、CD34(-)、CD45(-)。
(2)当ARTP处理hPDLSCs1min时，较处理0s、30s及2min者，hPDLSCs的ALP活性升高(P<0.05)，镜下可见细胞的矿化结节形成量增加(P<0.05)，RT-qPCR结果显示hPDLSCs的RUNX2、ALP和COL-I的mRNA表达增加(P<0.05)。
(3)使用ROS抑制剂预处理hPDLSCs，与空白组比较，仅ARTP处理细胞时，细胞内的ROS水平增高，NAC组的细胞内ROS水平降低；与ARTP处理组比较，NAC+ARTP处理组的细胞内的ROS水平降低。与ARTP处理组比较，NAC+ARTP处理组的细胞的ALP活性降低(P<0.05)，矿化结节形成量减少(P<0.05)，RT-qPCR结果显示细胞内RUNX2、ALP和COL-I的mRNA表达下降(P<0.05)。
结论：
(1)采用组织块法培养及有限稀释克隆法分离的hPDLSCs具有良好的增殖能力及分化潜能，并高表达干细胞表面标志分子。
(2)ARTP以一定时间处理hPDLSCs(1 min)，可以升高细胞内相关成骨基因的表达，提高细胞的ALP活性及矿化形成能力，最终促进hPDLSCs成骨向分化。
(3)在ARTP促进hPDLSCs成骨分化的过程中，ROS起到重要作用。
人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)是从人牙周膜组织中分离培养出来的一种间充质干细胞，该细胞具有较高的成骨活性，是修复牙周骨缺损的最具潜力的细胞之一。大气压常温等离子体(atmospheric room temperature plasma, ARTP)具有消毒灭菌、促进细胞增殖、诱导癌细胞凋亡等多方面的作用，它能够引起生物体体内的ROS发生变化，从而导致相应的生物学效应。本研究拟探寻ARTP对hPDLSCs成骨分化的影响，以及ARTP对胞内ROS的作用与细胞成骨分化之间的关系，从而探明ARTP对hPDLSCs成骨分化的影响及其可能机制。
方法：
(1)组织块法原代培养人牙周膜细胞，并采用有限稀释克隆法分离出hPDLSCs。结晶紫染色法测定hPDLSCs的克隆形成率；CCK-8法测定hPDLSCs的生长曲线；成骨及成脂向诱导检测hPDLSCs的分化潜能；流式细胞术检测hPDLSCs的表面CD90、CD146、CD34和CD45的表达。
(2)使用ARTP处理hPDLSCs，将细胞分为4组：1个空白对照组、3个实验组：ARTP分别处理30s、1min、2min，处理完成后对细胞行成骨诱导培养。碱性磷酸酶检测试剂盒测定成骨诱导培养7d和14d时hPDLSCs的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性；茜素红染色法及半定量分析检测成骨诱导培养21d时hPDLSCs的矿化形成情况；RT-qPCR检测成骨诱导培养3d和7d时hPDLSCs成骨基因的表达情况。
(3)使用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC )预处理hPDLSCs，以清除和抑制胞内ROS的形成，将细胞按如下分组进行处理：(i)空白组，(ii)NAC组，(iii)ARTP处理组，(iv)NAC+ARTP处理组，处理完成后对细胞行成骨诱导培养。处理完成后使用活性氧检测试剂盒检测细胞内的ROS变化；成骨诱导7d和14d，碱性磷酸酶检测试剂盒测定hPDLSCs的ALP活性；成骨诱导21d，茜素红染色法及半定量分析检测hPDLSCs的矿化形成状况；成骨诱导3d和7d，RT-qPCR检测hPDLSCs成骨基因的表达情况。
结果：
(1)原代培养的hPDLSCs呈梭形、三角形、多边形，其克隆形成率约为44%；生长曲线呈“S”形；细胞可成骨及成脂向分化；流式检测结果显示：CD90(+)、CD146(+)、CD34(-)、CD45(-)。
(2)当ARTP处理hPDLSCs1min时，较处理0s、30s及2min者，hPDLSCs的ALP活性升高(P<0.05)，镜下可见细胞的矿化结节形成量增加(P<0.05)，RT-qPCR结果显示hPDLSCs的RUNX2、ALP和COL-I的mRNA表达增加(P<0.05)。
(3)使用ROS抑制剂预处理hPDLSCs，与空白组比较，仅ARTP处理细胞时，细胞内的ROS水平增高，NAC组的细胞内ROS水平降低；与ARTP处理组比较，NAC+ARTP处理组的细胞内的ROS水平降低。与ARTP处理组比较，NAC+ARTP处理组的细胞的ALP活性降低(P<0.05)，矿化结节形成量减少(P<0.05)，RT-qPCR结果显示细胞内RUNX2、ALP和COL-I的mRNA表达下降(P<0.05)。
结论：
(1)采用组织块法培养及有限稀释克隆法分离的hPDLSCs具有良好的增殖能力及分化潜能，并高表达干细胞表面标志分子。
(2)ARTP以一定时间处理hPDLSCs(1 min)，可以升高细胞内相关成骨基因的表达，提高细胞的ALP活性及矿化形成能力，最终促进hPDLSCs成骨向分化。
(3)在ARTP促进hPDLSCs成骨分化的过程中，ROS起到重要作用。