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[目的]在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)的治疗中,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因的突变状态是表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)疗效的重要预测指标。但携带EGFR基因突变的NSCLC人群中EGFR-TKI疗效差别明显,这一问题仍无法解释。本研究旨在验证EGFR基因突变丰度的存在及其定量检测的方法,并探讨个体间突变丰度的差异对EGFR-TKI临床疗效的影响。[方法]NSCLC患者的肿瘤标本经常规DNA抽提,同时行直接测序和扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS)评估EGFR基因突变状态。进而完成以下三部分检测：①以H1650和H1975细胞系制作标准品,通过定量-PCR技术(Quantitative-PCR, q-PCR)生成标准曲线,从而定量标本EGFR突变型拷贝和总EGFR基因拷贝数；②行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)和克隆测序技术检测标本EGFR基因的扩增状态,并定量突变型与野生型拷贝的比值关系,定义为扩增系数；③采用特异性针对EGFR基因第19外显子E746-A750缺失和第21外显子L858R突变的单克隆抗体,通过免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)检测突变型EGFR蛋白的表达情况。随访并评估患者EGFR-TKI治疗的临床疗效。[结果]第一部分：根据q-PCR检测的EGFR突变型拷贝与总EGFR拷贝含量,并以HE染色切片评估的肿瘤细胞比例校正,从而得到EGFR分子水平的突变丰度值。该分子丰度值与克隆测序所得扩增系数间存在较好的相关性(P<0.001,Person值=0.61),证实了分子丰度定量检测的可靠性。以各病例的扩增系数校正相应的分子丰度,从而计算出含突变型EGFR的肿瘤细胞比例,即细胞丰度值。比较突变特异性IHC检测所得的染色肿瘤细胞比例与对应的细胞丰度,21例细胞丰度较高病例中,18例(85.7%)的特异性IHC染色肿瘤细胞比例也较高,而9例细胞丰度相对较低者,其中6例(66.7%)的IHC染色细胞比例也较低,Kappa检验结果显示两者间存在较好的一致性(P=0.004,Kappa值=0.52),细胞丰度定量检测的可靠性得到进一步验证。第二部分：入组的129例NSCLC患者中,共74例经直接测序和ARMS法均检出EGFR基因突变,归为高丰度组；另有12例标本的EGFR突变仅被ARMS检出而未被直接测序法检测,归为低丰度组,高丰度组患者的中位无疾病进展时间(progression-free survival, PFS)显著长于低丰度组(分别为17.0和5.0个月,P<0.001)。进一步根据定量计算的分子丰度值将患者分为高、低丰度组(以20%为界),两组的中位PFS分别为20.0和9.5个月,具有明显统计学差异(P=0.003)。单独分析L858R突变病例,其分子丰度的高低也与EGFR-TKI临床疗效密切相关(中位PFS,24.0和9.5个月；P=0.002),但在19外显子缺失病例中,分子丰度值与临床疗效的关系不明显(中位PFS,17.0和18.0个月；P=0.870)。按照EGFR突变细胞丰度值划分的高、低丰度组间,患者的中位PFS差异明显(20.0和10.0个月；P=0.013)。高细胞丰度组的客观有效率(objective response rate,ORR)为69.9%,在数值上较低丰度组的40%为高(P=0.139)。单独分析19外显子缺失病例,高丰度组的中位PFS明显长于低丰度组(19.0和10.0个月;P=0.035)；L858R突变病例的高、低丰度组间中位PFS也差别明显(22.0和10.0个月),但由于样本量相对不足,其差异未达统计学意义(P=0.072)。突变特异性IHC法检测结果显示,染色肿瘤细胞比例的高低与临床疗效密切相关(中位PFS,19.0和8.0个月；P=0.002)；而IHC弱染色病例与强染色病例EGFR-TKI治疗的中位PFS均为18.0个月,两组间无明显统计学差异(P=1.000)。由此进一步证实EGFR基因突变的细胞丰度与EGFR-TKI疗效呈正相关。[结论]本研究通过直接测序联合ARMS法、q-PCR技术、FISH和克隆测序、以及突变特异性IHC法完成了肺癌组织EGFR突变分子丰度与细胞丰度的定量检测,不同方法各有优缺点,检测结果相互印证。其中细胞丰度的检测修正了EGFR基因扩增等因素的影响,较为合理准确。本研究证实了非小细胞肺癌EGFR突变的异质性以及突变丰度的个体化差异,且突变丰度的高低与EGFR-TKI临床疗效间密切相关。