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草酸钙(CaOx)晶体在所有的光合生物中普遍存在,包括藻类,低等维管植物、裸子植物和被子植物。植物中,草酸钙晶体具有许多不同的功能,其主要功能是钙(Ca)的调节和植物的自我保护。超微结构和发育研究表明,在植物体内,内源产生的草酸和外源吸收的钙离子共同反应形成草酸钙晶体,这种生物矿化过程不是一个简单随机的物理化学沉淀。相反,晶体特定的形状和大小形成都受遗传调控。晶体异细胞的特异性是通过晶体内部形态的恒定性,以及晶体生长和细胞膨胀之间的协调性来表示。研究人员利用各种方法来揭示晶体异细胞所具有的精细控制机制,包括Ca的摄取和积累机制,草酸生物合成途径以及晶体生长的调节机制。 水烛(TyphaangustifoliaLinn.)是多年生的宿根挺水型水生单子叶植物,其根、茎、叶中形成的通气组织有效地促进了气体的扩散与交换。叶片特定的细胞通过降解形成溶生型通气组织。水烛溶生型通气组织的形成是PCD过程。水烛通气组织发育过程伴随着草酸钙晶体(针晶)的形成和降解的变化。草酸氧化酶(OXO)(草酸盐:氧化还原酶,EC1.2.3.4)能将草酸钙降解成二氧化碳(CO2)和过氧化氢(H2O2)。H2O2不仅可以作为植物发育和环境中诱导细胞程序性死亡(PCD)的关键因子,而且可以促进通气组织的形成。因此,本研究的目的是探明草酸钙晶体降解与通气组织形成之间的关系。本文的主要研究结果如下: (1)通过对水烛叶通气组织发育过程观察,在间隙期,晶体异细胞开始出现在PCD敏感区附近,晶体异细胞包含较多的草酸钙针晶单元,并且晶体的形状是规则的。在空腔期中,晶体异细胞始终分布在空腔周围,且晶体数量减少,形态变得不规则。当空腔通过大量细胞裂解成熟时,晶体异细胞及所含的晶体完全降解。 (2)用DAB组织化学染色观察H2O2,结果发现在晶体异细胞中出现强烈的红棕色(H2O2)着色。TBO染色结果显示,在间隙阶段,晶体异细胞比其他细胞染色更深。随着通气组织的发育,晶体异细胞的染色变得更加强烈。氯化铈细胞定位表明,在通气组织发育的间隙期和空腔形成期,大量的H2O2积累在细胞壁和细胞间隙中。空腔成熟后则不存在H2O2积累。 (3)采用实时定量PCR方法分析了水烛通气组织不同发育阶段中草酸氧化酶基因(TpOXO)以及与H2O2调控相关基因的表达。在草酸钙晶体降解期间,草酸氧化酶基因高度表达且活性最高,H2O2浓度在此阶段最高。此外,用H2O2的促进剂与抑制剂处理水烛的根状茎,发现H2O2会影响水烛叶通气组织的形成。 (4)成功克隆出水烛的草酸氧化酶基因,命名TpCOXO(登录号:MF407410),该基因cDNA全长为903bp,包括669bp的开放阅读框,63bp5非编码区,167bp3非编码区。该基因编码的TpCOXO蛋白包含223个氨基酸,预测的分子量和等电点分别为23.545kDa和5.74,属于疏水性蛋白。该蛋白属于草酸脱羧酶家族成员,系统进化树分析显示TpOXO与菠萝的OXO亲缘关系最近。 草酸钙晶体在特定组织或细胞类型中的形状特征和位置,可作为一个重要的植物分类学依据。植物的种类不同,草酸钙结晶具有的功能不同。水烛叶草酸钙针晶出现在通气组织PCD敏感区。当通气组织的空腔通过大量细胞降解形成时,伴随着草酸氧化酶的高表达和晶体降解,草酸钙晶体降解产生H2O2,H2O2作为信号分子参与通气组织PCD过程的调控。这项研究首次揭示了草酸钙晶体降解产生H2O2参与通气组织PCD的新功能。