原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内发病率第六位的恶性肿瘤,并在癌症相关疾病死亡率中高居第二位;在众多致癌机制中,乙型肝炎病毒(HBV)DNA整合入宿主基因组是肝癌发生发展的一个重要因素,而且HBV整合是一个早期事件,其可以发生在肝炎的早期阶段;以往受制于测序深度不够的原因,人们一直将HBV DNA在宿主基因组上的整合当做一个随机事件,但近几年,随着测序技术的发展,特别是全基因组测序的应用,人们发现HBV整合并不是一个随机事件,并表明HBV的整合与病人的预后明显相关;目前比较认可的HBV整合致癌机制主要有三点:1:上调肝癌细胞中高频整合癌基因的表达水平;2:整合入宿主的HBV DNA的编码产物HBX、截短的包膜pre-S2/S蛋白发挥诱癌促癌作用;3:整合导致细胞周期紊乱以及基因水平的不稳定;此外,有文献报道,HBV整合的致癌促癌机制主要取决于其所整合的宿主基因的生物学功能;然而关于HBV整合高频基因在HBV整合致癌及其促癌机制中究竟发挥了怎样的作用,依然没有一个结论;在之前文献报道的一群HBV高频整合基因中,端粒酶逆转录酶(TERT,telomerase reverse transcriptase)是整合频率最高的基因,HBV整合会明显上调TERT的表达水平;但限制于样本量及测序深度的原因,其具体的HBV-TERT整合的临床相关性及其HBV整合上调TERT表达水平的具体机制却缺乏相应的研究;TERT作为了HBV整合频率最高的基因,其本身又是一个公认的癌基因,其究竟在HBV整合致癌促癌机制中扮演着怎么样的角色呢?针对这一疑问,我们开展了445例HBV靶向捕获测序,并将我们的研究重点集中在HBV-TERT整合这一单一事件,旨在通过研究HBV-TERT这个最高频的整合事件加深我们对HBV整合机制的了解。第一部分HBV-TERT整合的临床相关性及其HBV整合上调TERT表达量的机制研究目的:探讨HBV-TERT整合的临床相关性及HBV整合后上调TERT表达量的具体机制,探讨HBV整合与TERT多种遗传元件之间的相关性。方法:我们通过一个高通量病毒整合测序法来检测样本中(445例)的HBV的整合情况,该方法的测序精度能细化到单个碱基对;对于后续数据的分析我们主要将分析的重点靶定在HBV-TERT整合事件上,详细分析了HBV-TERT整合的临床相关性;为了阐述HBV整合引起的TERT异常上调的具体机制,我们应用双荧光素酶报告系统检测HBV整合序列对TERT启动活性的影响;除此之外,我们还检测了TERT基因组整合位点附近的突变情况、甲基化状态及其染色质的松散结构。结果:在本实验中,我们发现TERT不仅是HBV最高频整合基因,而且HBV在TERT上的整合也不是随机分布的,TERT基因组上存在着一个HBV高频整合区段;通过临床相关性分析我们发现,HBV-TERT整合与性别及微血管侵犯相关,相较于女性患者,男性患者更容易发生HBV-TERT整合,此外与非整合组的病人相比,HBV-TERT整合组的总体生存率要差(P=0.046);此外我们发现,HBV整合对TERT表达调控的影响是通过整合位置及其整合序列决定的;我们分析了HBV-TERT整合与TERT的突变、甲基化、染色质松散结果之间的相关性,我们发现TERT的甲基化状态、染色质松散结构与HBV整合之间无相关性,但TERT的突变要明显与HBV整合呈负相关。结论:HBV-TERT整合在HBV整合相关的致癌机制中发挥了重要的作用;在HBV相关肝癌里,HBV整合在TERT的上调中发挥了重要,其上调作用是由HBV整合的位置及其整合的序列决定的。第二部分过表达TERT能促进肝癌细胞系SMMC-7721的转移能力目的:研究TERT在肝癌中的非端粒酶依赖性功能。方法:我们详细分析TERT表达量的临床相关性,并进一步构建了TERT稳转过表达的SMMC-7721肝癌细胞系,通过细胞划痕实验、细胞穿梭实验研究TERT对肝癌的转移能力的影响,并进一步通过裸鼠尾静脉注射肺转移模型研究在动物体内TERT对肝癌细胞转移能力的影响。结果:TERT的表达量与肝癌病人中的微血管侵犯相关,相较于TERT低表达而言,TERT高表达的病人更容易出现微血管侵犯(χ2=4.061,P=0.044);进一步通过细胞划痕实验、细胞穿梭实验以及裸鼠尾静脉注射肺转移模型证明TERT能促进肝癌细胞的转移能力。