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细胞自噬是一条在真核细胞中高度保守,又受到紧密调控的分子途径。细胞自噬帮助细胞降解胞质中不再被细胞需要的蛋白,细胞器以及从胞外入侵的微生物,从而维持胞内的自稳态,抵抗饥饿,消除突变蛋白等。这个降解过程是由一个双层膜结构-细胞自噬体-包裹并运送到溶酶体来完成的。在极端情况下,细胞自噬又能够诱导细胞死亡。细胞自噬功能的缺失与很多人类疾病相关联,如神经退行性疾病,糖尿病和肿瘤等。通过对细胞自噬分子机理的研究,有可能找到控制这些疾病的方法。细胞自噬过程需要一组蛋白分子协同作用。在酵母中进行遗传学筛选,发现了30多个在细胞自噬过程中发挥作用的基因,这些基因被命名为细胞自噬相关基因(ATG, AuTophaGy),而且这个数字还在不断的增长。对细胞自噬形成最不可或缺的基因被称为核心分子,其中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)在这些核心分子中扮演至关重要的作用,它能够磷酸化磷脂酰肌醇(PI)形成磷脂酰肌醇三磷酸(PI3P), PI3K在细胞自噬体形成过程的最上游发挥功能,并且还决定着其他下游分子对细胞自噬的调节作用。酵母中的PI3K是由Vps34和Vps15组成,它与细胞自噬的关键蛋白ATG6形成一个复合体,该PI3K复合体在细胞自噬和膜泡蛋白运输过程中都有作用。PI3K复合体中的ATG6通过与Vps38或ATG14直接作用决定该复合体在哪条途径中起作用：与Vps38结合的PI3K调节膜泡蛋白运输；而与ATG14结合的PI3K调节细胞自噬。hVps34和p150是哺乳动物中PI3K的同源蛋白,它们形成蛋白复合体第三类磷脂酰肌醇3激酶(PI3KC3),再与ATG6的同源蛋白Beclin1相互作用形成PI3KC3-Beclin1复合体,该复合体能够调节细胞自噬和内吞途径。本文主要探讨以下三方面内容：1,通过蛋白纯化的方法,获得一个新蛋白Barkor (Beclin 1-associated autophagy-related key regulator),并对它在细胞自噬中的功能进行了研究。1.1利用免疫共沉淀和体外直接作用,证明Barkor能够与Beclin1直接作用,并且能带领PI3KC3至细胞自噬体表面发挥功能；1.2对PI3KC3的激酶活性进行检测,证明Barkor能够显著增加PI3KC3的激酶活性;1.3抑制Barkor蛋白的表达直接导致细胞自噬水平降低,而过量表达Barkor显著提升了细胞内的自噬水平,从而显示Barkor是细胞自噬途径中的关键蛋白。2,进一步分析Barkor蛋白的序列和结构,寻找到Barkor内部的一个新结构域BATS (Barkor Autophagosome Targeting Sequence),这是目前为止发现的第一个细胞自噬体特异性结合蛋白序列。2.1通过观察不同Barkor片段与细胞自噬体的结合能力,最终确定BATS位于Barkor羧基末端的80个氨基酸内；2.2氨基酸结构分析发现BATS包含一个两亲性螺旋(Amphiphathic helix),该两亲性螺旋可直接与细胞自噬体表膜作用。突变这个两亲性螺旋的三个疏水氨基酸或者直接切除10个氨基酸的Barkor不能再结合到细胞自噬体表面；2.3体外膜结合实验证明BATS能够直接结合体外生物膜。3,纯化LC3蛋白复合体,发现了另外一个在细胞自噬途径中发挥关键作用的蛋白Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1)3.1通过免疫共沉淀发现Keap1与LC3和p62在一个蛋白复合体中,Keap1与p62的相互作用能够被氧化胁迫诱导；3.2对细胞自噬过程中的Keap1蛋白水平进行跟踪分析证明Keap1并不是细胞自噬途径的底物；3.3观察Keap1基因敲除细胞内的泛素化蛋白显示Keap1调节细胞对泛素化蛋白的降解;3.4观察Keap1野生型和基因敲除细胞在泛素化蛋白聚集情况下的生存状态,证明Keap1对细胞抵抗泛素化蛋白的毒性至关重要。