IER5为Immediate Early Response gene 5基因的简称，是早期反应基因家族中的一员。经检索国内外文献获悉，目前人们对IER5基因研究不是很多，现有的研究显示IER5基因表达变化对细胞周期和细胞凋亡具有调节作用，参与了细胞对促有丝分裂信号反应的调节。我们前期研究结果显示：辐射后淋巴母细胞(AHH-1)、宫颈癌(Hela)细胞和肝癌(HepG2)细胞的IER5基因表达上调；抑制IER5基因表达，Hela和HepG2细胞增殖变快，细胞对辐射的拮抗性增强，辐射敏感性减弱，且IER5基因沉默Hela细胞体积比正常肿瘤细胞大；与之相反，增加IER5表达，Hela和HepG2细胞增殖减慢，且IER5基因高表达Hela细胞尺寸明显小于正常肿瘤细胞、辐射后凋亡比例增大，IER5高表达细胞的抗辐射能力减弱，辐射敏感性增强。这些研究提示我们IER5基因与肝癌、宫颈癌的发生、发展有关，参与了细胞周期的调控，可能类似于抑癌基因的功能。这些研究结果提示我们有必要对IER5基因展开更深入的研究，进一步阐明该基因的生物学功能，有可能为肿瘤放疗寻找到新的辐射敏感基因，以提高临床肿瘤放疗效果。　　 IER5为没有内含子的基因，整个cDNAGC含量为60.5％（开放阅读框架为71.7％），在PCR过程成中形成复杂的二级结构，给人工合成IER5融合蛋白和单克隆抗体带来难度。单克隆抗体具有易于制备、理化性质均一、生物活性单一、特异性强、易于标准化等优点。使用单克隆抗体，能提高免疫学检验和临床治疗的特异性和准确性，对生物、化学、医学、免疫学等领域有着重要的意义[13]。目前市场只有IER5多克隆抗体，在用于蛋白质免疫沉淀实验中与IER5相互作用蛋白和Western-blot实验中IER5蛋白的检测时效果不佳，这给进一步研究IER5基因的生物学功能带来困难，因此本课题组决定制备IER5单克隆抗体，合成IE5融合蛋白是制备IER5单克隆抗体的关键一步，由于研究时间有限，本研究拟采用Real-timePCR、SDS-PAGE、Western blot等方法制备大量重组IER5融合蛋白，为制备IER5单克隆抗体做准备，为进一步深入研究IER5基因在肝癌等肿瘤辐射治疗中的作用奠定基础。　　 目的：本课题采用PCR、SDS-PAGE、Western blot等方法，通过诱导表达、超声破碎、变性、复性、过NI-NTE镍柱、透析、聚乙二醇浓缩等实验技术纯化蛋白以获得大量IER5重组融合蛋白，为IER5单克隆抗体制备做准备。　　 方法：人工合成IER5基因，将该基因转入原核表达载体pET22b(+)和pGEx-5T中，转化感受态细胞DH5α，进行测序分析。测序正确后，提取质粒，再将质粒转化感受态E.coli BL21(DE3)。即构建原核pET22b(+)-IER5、pGEx-5T-IER5表达载体，通过异丙基2B2D2硫代半乳糖苷(IPTG)在大肠杆菌系统稳定地表达融合蛋白pET22b(+)-IER5，利用Western blot和SDS-PAGE检测pET22b(+)-IER5。应用咪唑与融合蛋白竞争地与镍离子结合将融合蛋白洗脱下来。　　 结果：成功构建pET22b(+)-IER5、pGEx-5T-IER5表达载体，转化入大肠杆菌,筛选阳性克隆将pET22b(+)-IER5诱导表达。确定了其原核表达的关键表达参数：诱导温度为37度，诱导时间为4h及IPTG浓度为0.01mmol/l，使之可以在大肠杆菌中稳定表达。通过8M尿素变性、HisTrapHP亲和层析柱、透析、浓缩等技术获得表达产物pET22b(+)-IER5融合蛋白，以包涵体形式为主，表达量占菌体总蛋白的20％，纯化后证明表达产物具有较高纯度达到95％。　　 结论：本研究成功构建了人IER5基因的原核表达载体pET22b(+)-IER5、pGEx-5T-IER5，并纯化了该基因的原核表达产物pET22b(+)-IER5融合蛋白。获得了纯度的达到95％的IER5融合蛋白，为免疫动物和筛选单克隆抗体做准备。