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胆管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是侵袭性强的胆管上皮性腺癌,是最常见的原发性肝胆恶性肿瘤之一。CCA的发生率仅次于肝细胞癌,到目前为止手术切除仍然是治疗CCA最有效的方法。尽管在外科手术和化学疗法方面已经取得了很多进展,但CCA患者的预后依然不良。由于对CCA发生发展的分子机制认识尚有不足,一定程度上阻碍了CCA相关新药的开发和应用。因此,迫切需要寻找新的靶标分子来提高CCA患者的生存率。本研究中,我们通过对已发表的胆管癌公共数据集进行生物信息学分析,最终筛选出在m RNA和蛋白水平表达都显著上调的肾母细胞瘤过表达基因(Nephroblastoma overexpressed gene,NOV)并深入分析其功能,进一步设计实验,验证其在胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用以及分子机制的研究。NOV(又名CCN3)是CCN家族6个成员之一。基于CCN家族在肿瘤生物进程中扮演的重要角色,我们对其家族6个成员在10种泛癌数据集中进行了生物信息学分析,结果表明NOV在不同肿瘤病人中具有差异表达多样性,其中在胆管癌、卵巢癌、胰腺癌中显著上调,在其他7种肿瘤中显著下调。胆管癌中,NOV是CCN家族6个成员中上调表达最显著的分子。NOV已被证明可以调节多种人类癌症中的多种病理生理过程,但其在胆管癌中的高表达和生物学功能仍然未知。本研究旨在探讨NOV对胆管癌细胞增殖、迁移及侵袭的调控作用。首先我们通过荧光定量PCR(q-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)实验验证NOV在两种CCA细胞HCCC9810(以下简称9810)和RBE中是否和生物信息学预测(NOV在CCA中高表达)一致,然后连接NOV基因于pc DNA3.0载体中使其在9810和RBE细胞中有效过表达,并将该实验分为阴性对照组(pc DNA3.0)和过表达组(NOV);应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术将靶向NOV的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染至9810和RBE细胞中,有效沉默NOV的表达,并将该实验分为阴性对照组(si-NC)和沉默组(si-NOV-1,si-NOV-2)。依次分别进行如下实验:在9810和RBE细胞中通过q-PCR和Western Blot分别检测细胞中NOV的m RNA和蛋白表达情况;通过CCK-8细胞增殖实验和细胞集落形成实验观察NOV对9810和RBE细胞增殖能力的影响;利用细胞划痕和Transwell小室进行迁移实验来检测NOV对9810和RBE细胞迁移能力的影响;利用Transwell小室微孔膜上室面均匀涂上基质胶进行细胞侵袭实验,以此来观察NOV对9810和RBE细胞侵袭能力的影响;利用Western Blot技术检测细胞中上皮标志物蛋白E-cadherin和间质标志物蛋白Vimentin,N-cadherin,Snail和MMP9的表达水平;利用Western Blot技术探究NOV下游调控分子;利用生物信息学预测以及双荧光素酶报告系统分析,探究micro RNA调控NOV在CCA细胞中的上调机制。结果显示,NOV在9810和RBE中的表达显著高于正常人胆管上皮细胞HIBEC(P<0.001)。过表达NOV显著促进了9810和RBE细胞的迁移和侵袭,相反的,沉默NOV显著抑制了9810和RBE细胞的迁移和侵袭。但NOV对9810和RBE细胞的增殖无明显影响(P>0.05)。此外,过表达NOV的9810和RBE细胞中上皮标志物E-cadherin表达显著下调,而间质标志物Vimentin,N-cadherin,Snail,MMP9表达显著上调;相反的,沉默NOV的9810和RBE细胞中上皮标志物E-cadherin表达显著上调,而间质标志物Vimentin,N-cadherin,Snail,MMP9表达显著下调,说明NOV可以促进胆管癌细胞9810和RBE的上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)进程。机制上,我们首先检测出NOV的下游调控分子,NOV可以正向调控Notch1信号通路;接着我们发现CCA细胞中与NOV表达模式相反的miR-92a-3p,可以与NOV的3’UTR区直接结合从而负调控NOV的表达。miR-92a-3p模拟物与NOV过表达质粒共转9810细胞后,可以有效逆转NOV过表达引起的促进细胞迁移和侵袭效应,同样地,加入miR-92a-3p模拟物后也可以有效逆转NOV过表达引起的上皮间质转化进程。综上,miR-92a-3p参与了NOV介导的CCA细胞的迁移和转移。因此,NOV可以作为CCA前期诊断和治疗的潜在靶点。本研究为开发以NOV为靶点的CCA抗肿瘤药物提供了实验数据基础和分子理论依据,丰富了对CCA发病分子机制的认识。