[目的]基于行为学、形态学、组织细胞学与分子生物学的综合评价,探究三法三穴推拿干预是否可以调控SNI大鼠脊髓至外周运动通路细胞自噬进程,并以脊髓腹角为切入点,从Akt-mTOR通路及AMPK-mTOR通路的角度,深入研究三法三穴调节运动神经元细胞自噬的分子途径,进一步理清推拿促进周围神经损伤运动功能恢复的内在机制。[方法]对坐骨神经损伤模型(SciaticNerve Injury,SNI)大鼠进行定性定量的三法三穴推拿干预,从超微形态学、组织细胞学及分子生物学三个层面阐述推拿调节细胞自噬促进SNI大鼠运动功能恢复的潜在机理:1.以坐骨神经功能指数验证疗效,采用透射电镜观察并分析脊髓至外周运动通路自噬体的生成和组织超微结构的变化,探寻三法三穴促进SNI大鼠后肢精细动作恢复的超微形态学依据;2.以腓肠肌湿重评价肌肉萎缩情况,通过分子生物学方法,检测自噬相关蛋白LC3及p62表达变化,分析三法三穴调节细胞自噬减缓失神经肌肉萎缩的内在规律;3.以斜板试验评价后肢肌力的变化,采用鞘内注射自噬诱导剂雷帕霉素为阳性药物对照,以双重免疫荧光标记法检测脊髓腹角LC3与NeuN共表达情况,并以分子生物学方法检测p-mTOR、p-Akt及p-AMPK等细胞自噬上游关键因子的表达,以期进一步分析三法三穴是否可以调节脊髓运动神经元细胞自噬及其潜在分子机制。[结果]1.三法三穴调节SNI大鼠脊髓至外周运动通路自噬体的形成促进组织超微结构的恢复1.1.行为学结果坐骨神经功能指数:干预第0次,与假手术组比较,模型组大鼠SFI显著降低(P<0.01)。干预第10次,与模型组比较,三法三穴组大鼠SFI结果升高(P<0.05)。干预第15次及第20次,与模型组比较,三法三穴组SFI结果显著升高(P<0.01)。1.2.脊髓腹角电镜结果造模后28天,电镜下模型组可见运动神经元核仁固缩明显,核膜凹凸不平,染色质深染聚集于核膜附近,胞质内可见自噬体及溶酶体。三法三穴组脊髓腹角神经元核仁、核膜改变较模型组轻,细胞质内自噬体及自噬溶酶体较模型组明显增加(P<0.05,P<0.01)。1.3.坐骨神经损伤点电镜结果造模后28天,电镜下模型组可见神经纤维髓鞘重度崩脱、扭曲,轴索严重萎缩甚至消失;轴索内线粒体呈现空泡状。三法三穴组可见大部分神经纤维髓鞘保留较完整,轴索无肿胀或萎缩,轴索内自噬溶酶体较模型组增加(P<0.05)。1.4.腓肠肌电镜结果造模后28天,电镜下模型组可见肌丝排列紊乱横纹消失,卫星细胞胞核极不规整,见大量空泡状线粒体。电镜下三法三穴组肌丝排列较整齐,横纹出现;可见清晰Z线及M线;卫星细胞细胞核较模型组规整,腓肠肌肌束间隙自噬体及自噬溶酶体较模型组增多(P<0.01,P<0.05)。2.三法三穴调控坐骨神经损伤点及腓肠肌细胞自噬促进SNI大鼠运动功能恢复2.1.行为学结果腓肠肌湿重:干预第0次,与假手术组比较,模型组大鼠腓肠肌湿重显著降低(P<0.01)。干预第20次,与模型组比较,三法三穴组大鼠腓肠肌湿重明显升高(P<0.01)。2.2.坐骨神经损伤点细胞自噬标记蛋白LC3、p62表达变化干预第0次,与假手术组比较,模型组大鼠坐骨神经损伤点LC3表达上调(P<0.05)。干预第20次,模型组大鼠坐骨神经损伤点LC3表达与假手术组无显著差异(P>0.05);与模型组比较,三法三穴组LC3表达上调(P<0.05)。干预第0次,与假手术组比较,模型组大鼠坐骨神经损伤点p62表达上调(P<0.01)。干预第20次,模型组较假手术组坐骨神经损伤点p62仍显著增高(P<0.01);与模型组比较,三法三穴组大鼠坐骨神经损伤点p62表达显著降低(P<0.05)。2.3.腓肠肌细胞自噬标记蛋白LC3、p62表达变化干预第0次,与假手术组比较,模型组大鼠腓肠肌中LC3表达显著上调(P<0.01)。干预第20次,与假手术组相比,模型组大鼠LC3表达仍较高(P<0.05);三法三穴组LC3表达与模型组相比无差异(P>0.05)。干预第0次,与假手术组比较,模型组大鼠腓肠肌中p62表达显著上调(P<0.01)。干预第20次,与假手术组相比,模型组大鼠腓肠肌中p62仍趋于较高水平(P<0.01);与模型组比较,三法三穴组p62表达降低(P<0.05)。3.三法三穴调控脊髓腹角神经元细胞自噬促进SNI大鼠运动功能恢复3.1.行为学结果斜板试验:干预第0次,与假手术组比较,模型组斜板试验角度显著降低(P<0.01)。干预第4次,与溶剂组比较,雷帕霉素组斜板角度升高(P<0.05)。干预第6次至第20次,与溶剂组比较,雷帕霉素组斜板角度显著升高(P<0.01)。干预第6次,三法三穴组斜板角度升高(P<0.05)。干预第10次至第20次,与模型组比较,三法三穴组斜板角度显著升高(P<0.01)。3.2.脊髓腹角LC3/NeuN双重免疫荧光标记结果干预第0次,与假手术组相比,模型组脊髓腹角LC3/NeuN共表达量增加(P<0.05)。干预第20次,与假手术组比较,模型组脊髓腹角LC3/NeuN共表达量仍处于上调状态(P<0.05);与溶剂组相比,雷帕霉素组LC3表达显著增高(P<0.01);与模型组比较,三法三穴组LC3表达也较高(P<0.05),但与雷帕霉素组仍存差异(P<0.05)。3.3.脊髓腹角自噬体降解标记蛋白p62表达变化干预第0次,与假手术组相比,模型组脊髓腹角p62表达显著增加(P<0.01)。干预第20次,与假手术组相比,模型组p62表达仍然处于上调阶段(P<0.01);与溶剂组相比,雷帕霉素组p62表达显著下降(P<0.01);与模型组比较,三法三穴组p62表达下降(P<0.05),但与雷帕霉素组仍有显著差距(P<0.01)。3.4.脊髓腹角细胞自噬上游mTOR-ULK信号通路关键因子表达结果干预第0次,与假手术组相比,模型组p-mTOR与p-ULK表达增高(P<0.01)。干预第20次,与假手术组相比,模型组p-mTOR与p-ULK仍处于上调状态(P<0.01);溶剂组与模型组无显著差异(P>0.05);与溶剂组比较,雷帕霉素组p-mTOR显著降低(P<0.01),p-ULK显著上升(P<0.01);与模型组比较,三法三穴组p-mTOR降低(P<0.05),p-ULK上调(P<0.05),但与雷帕霉素组仍存差异(P<0.01)。3.5.脊髓腹角mTOR通路上游AMPK表达结果干预第0次,与假手术组比较,模型组脊髓腹角p-AMPK表达无显著差异(P>0.05)。干预第20次,与假手术组比较,模型组脊髓腹角pAMPK表达同样无显著性差异(P>0.05);溶剂组、雷帕霉素组与模型组无显著性差异(P>0.05);与模型组比较,三法三穴组脊髓腹角p-AMPK表达增加(P<0.05)。3.6.脊髓腹角mTOR通路上游Akt表达结果干预第0次,,与假手术组相比,模型组p-Akt表达增高(P<0.05)。干预第20次,与假手术组相比,模型组p-Akt表达仍处于上调状态(P<0.01);溶剂组与模型组无统计学差异(P>0.05);与溶剂组相比,雷帕霉素组p-Akt表达显著下调(P<0.05);与模型组相比,三法三穴组无显著性差异(P>0.05)。[结论]1.三法三穴干预可以促进SNI大鼠脊髓腹角至外周运动通路自噬体的生成,保护运动神经元、轴索及肌纤维超微结构的稳定,促进SNI大鼠后肢精细动作的恢复;2.三法三穴干预可以加速SNI大鼠神经损伤点与腓肠肌细胞自噬进程,使损伤点与失神经肌肉细胞加快清除与再利用坏死的细胞器,减缓肌肉的萎缩;3.三法三穴干预可以促进SNI大鼠后肢肌力的恢复,其潜在机制是促进脊髓腹角神经元细胞自噬,三法三穴对细胞自噬的调节是通过AMPK-mTOR信号通路完成的,而不是依靠Akt-mTOR信号通路实现的。