本研究以大造家蚕为材料,取5龄3天的家蚕头部、中肠、脂肪体、丝腺、精巢、卵巢和血淋巴。以家蚕脂肪体cDNA为模板克隆家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin-6)基因;以头、中肠、脂肪体、丝腺、精巢、卵巢和血淋巴cDNA为模板做半定量分析。用脂多糖(LPS)刺激5龄3天家蚕后分时间段取其血淋巴和脂肪体,然后以其cDNA为模板做半定量分析。采用大肠杆菌原核表达系统进行家蚕Serpin-6基因的表达研究。主要研究结果如下:1.利用BLAST程序,将昆虫Serpin保守序列与家蚕EST数据库进行比对,拼接后得到一段包含完整ORF的预测的家蚕Serpin序列;根据此序列设计合适的引物,采用RT-PCR方法以5龄3天大造家蚕脂肪体为材料提取mRNA,克隆了家蚕Serpin-6基因(GenBank登录号:EU159447)。序列分析表明,家蚕Serpin-6基因编码区长度为1 242 bp,编码413个氨基酸,相对分子量约为46.47 kDa,等电点约为5.48,成熟蛋白质的分子量约为44.62 kDa。与其他昆虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂同源比较发现该基因与烟草天蛾Serpin-6基因氨基酸序列的相似性最高,达77.67%,与冈比亚按蚊Serpin-9的次之,相似性为39.51%。而与家蚕Serpin-5的相似性只有22.37%。推测家蚕Serpin-6与烟草天蛾Serpin-6可能属于直系同源基因,起着相同或类似的作用。将该基因全长cDNA与家蚕基因组比对后发现该基因包括8个外显子,7个内含子。用Signal P 3.0 Server程序分析家蚕Serpin-6基因,预测其N-末端第1到第17个氨基酸残基为信号肽序列。2.根据获得的家蚕Serpin-6基因ORF序列,设计一对引物,进行半定量RT-PCR反应。以5龄3天大造家蚕幼虫的头、中肠、脂肪体、丝腺、精巢、卵巢和血淋巴及免疫刺激后不同时间段脂肪体和血淋巴cDNA为模板进行RT-PCR,PCR扩增产物预期大小为349 bp,以家蚕actin 3基因为内参。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,并进行半定量计算。结果表明,Serpin-6在家蚕头部及6个组织中均有表达。在家蚕头、精巢和卵巢中的表达量最高,在中肠和丝腺中的表达量次之,在脂肪体和血淋巴中的表达量最低。用LPS诱导5龄3天的家蚕,取不同时间段的脂肪体和血淋巴做半定量表达研究,结果表明,Serpin-6基因在家蚕脂肪体中经诱导后3 h表达量上调,到6 h时达到最高,之后逐渐下降。诱导后Serpin-6基因在家蚕血淋巴中的表达情况同诱导脂肪体一样,诱导3 h后该基因表达量呈上调趋势,在诱导后6 h时,该基因的表达量达到最高,之后从6 h到12 h,24 h逐渐下降,24 h时降到该诱导组的最低。由此推测,家蚕Serpin-6基因具有免疫功能,另外,根据该基因在家蚕头部及6个组织中的表达差异推测它或许还有其他的功能,这将有待更进一步的研究。3.将去掉信号肽的家蚕Serpin-6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经1 mmol/L IPTG诱导蛋白质表达。SDS-PAGE电泳分析结果表明,家蚕Serpin-6基因以融合蛋白形式表达,经IPTG诱导转化去信号肽家蚕Serpin-6的BL21菌与对照BL21菌、空pET-28a(+)转化BL21菌和非诱导转化去信号肽家蚕Serpin-6的BL21菌相比出现了一条特异性的蛋白质条带,相对分子量约45kDa,推测家蚕Serpin-6在大肠杆菌中得到表达。经Western blot分析表明在预测的约45 kDa大小位置出现较明显的条带,与推导的融合蛋白分子量相符。而对照BL21菌、空pET-28a(+)转化BL21菌和非诱导转化家蚕Serpin-6的BL21菌都没有检测到条带,进一步证明了去信号肽家蚕Serpin-6在大肠杆菌中成功表达。而含有信号肽的家蚕Serpin-6在同样的实验条件下,没有检测到特异性蛋白条带。因此推测含有信号肽的家蚕Serpin-6在原核表达体系中不能成功表达可能是受其信号肽序列的影响。家蚕Serpin-6基因的成功克隆、组织半定量表达、LPS刺激后在不同时间段的半定量表达和原核表达研究为进一步从分子水平上解析Serpin与家蚕免疫体系的关系,为研究家蚕及鳞翅目昆虫的免疫防御提供了参考。