骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BM-MSC)是存在于骨髓质中除HSCs之外的另一类具有自我复制、更新能力和多向分化潜能的非造血组织干细胞。在一定的体内和体外诱导条件下，可以分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、基质细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、星形胶质细胞和神经元细胞。研究发现MSC具有易于分离培养、低免疫原性、易于外源基因的转染和表达的特性，而且MSCs能够加速HSCs归巢和植入，多方面促进造血，下调异基因免疫反应等特点，使MSCs与HSCs共移植治疗恶性血液病成为热点，并广泛应用于组织工程、基因治疗等其它领域。　　 外源性MSCs输注辅助HSCT已证实具有良好促进造血的效果且无明显的毒副反应；关于MSCs移植后在体内的分布特点和生物学行为尚无一致结论，在动物实验和临床研究中发现MSCs归巢骨髓有所不同，在多数的动物实验中从骨髓可以检测到供体源性MSCs，而人体的临床研究却证实成功植入的患者骨髓中MSCs仍为受体源性，可能跟动物和人体的检测方法不同有关，大多数动物的示踪方法不能应用于人体。因此，了解MSC移植后体内的分布特点和生物学行为，有助于阐明MSC辅助重建造血的机制。　　 目前MSC示踪的方法很多不能运用于人体，因此寻找安全、无毒副作用且适用于人体，可长期、在体追踪BM-MSC自身归巢和定植的方法，将为探索BM-MSC辅助造血重建的机制提供一个良好的实验平台。本实验将酪氨酸酶基因体外转染MSC，输注体内后以MRI技术在体显像，以期得到清晰的MSC定植的解剖生理图像，为可以直观、无创性地长期在体示踪MSC的归巢和定植打下基础。　　 本文拟进行以下四部分研究：　　 第一章、小鼠MSC的分离、培养和鉴定。　　 目的：从小鼠骨髓中分离培养、扩增和纯化MSC，研究其表面标记及分泌的细胞因子水平等生物学特点，建立稳定、高效的体外培养体系，为下一步MSC的转染和移植提供实验基础。　　 方法：　　 1.MSC的分离培养、扩增和纯化。全骨髓贴壁法(自然贴壁法)从小鼠骨髓分离单个核细胞，以2×106/cm2密度接种在25cm2培养瓶中，37℃，5％CO2饱和湿度下常规培养，每3～4天换液，原代培养至细胞接近80％融合时(7～10天)用0.25％胰酶消化，进行传代、扩增培养。倒置相差显微镜逐日观察细胞形态、贴壁情况及生长情况。　　 2.MSC表面标记的检测。取生长状态良好的P3～P5代BM-MSC，用流式细胞仪检测BM-MSC免疫表型CD29、CD44、CD105、CD166、CD34、CD45、CD106及CD54的表达。　　 3.BM-MSC分泌的细胞因子的检测。ELISA法检测BM-MSC上清中小鼠干细胞(SCF)、小鼠基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、小鼠白介素6(IL-6)的水平。　　 结论：　　 1.在适宜的体外培养条件下，可从小鼠骨髓中成功分离MSC，并且纯化和大量扩增。　　 2.培养的MSC形态、免疫表型、分泌的细胞因子均符合间充质干细胞的特征。　　 第二章、酪氨酸酶基因质粒的提纯及MSC转染。　　 目的：纯化含酪氨酸酶基因完全cDNA的pcDNA3tyr质粒，用脂质体法将其转染到MSC，为下一步MSC输注体内后实现MRI在体显像示踪提供实验基础。　　 方法：　　 1.pcDNA3tyr质粒的纯化。采用CaC12转化法法将pcDNA3tyr质粒导入大肠杆菌DH5α菌株，从琼脂平板上挑取含有外源基因质粒的大肠杆菌DH5α单菌落，然后接种于2个30mlLB培养基的锥形瓶里，37℃250rpm振荡过夜。按照QIAGENPlasmidMidi试剂盒说明纯化pcDNA3tyr质粒。　　 2.pcDNA3tyr质粒的鉴定。pcDNA3tyr质粒经Xba 1、EcoRⅠ双酶切，随后经琼脂糖电泳，电泳完毕后，取出凝胶，采用凝胶成像系统拍照保存。　　 3.pcDNA3tyr质粒转染MSC转染前一天，胰酶消化细胞并计数，接种于24孔板中，以脂质体法按照LipofectamineTM 2000试剂盒说明每孔转染0.8μg pcDNA3tyr质粒。　　 4.转染前后MSC的鉴定。　　 4.1 转染前后MSC的形态学观察。　　 4.2 转染前后MSC的表面标记。用流式细胞仪检测转染前后MSC免疫表型CD29、CD44、CD105、CD166、CD34、CD45、CD106及CD54的表达。　　 4.3 转染前后BM-MSC细胞因子的分泌。　　 5.MSC内酪氨酸酶基因的鉴定。　　 (1)提取总RNA后行RT-PCR，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，与DNA分子量marker进行比较。　　 (2)用RT-PCR法分别在转染后24小时、48小时、72小时、7天检测TYR基因的mRNA的表达量。方法同前2.4.3。　　 6.统计学处理。本实验计量资料以X±SD表示，采用SPSS11.5统计软件包处理，各实验组间比较用LSD-t检验两两组间比较。P＜0.05被认为有统计学意义。　　 结论：　　 1.脂质体法能够成功将pcDNA3tyr质粒转染MSC，并且证实是稳定和可靠的。　　 2.转染后的MSC形态、免疫表型、分泌的细胞因子均符合间充质干细胞的特征，转染前后MSC的生物学特性无改变。　　 第三章、酪氨酸酶基因质粒转染MSC体外细胞及小鼠体内黑色素染色。　　 目的：含酪氨酸酶基因完cDNA的pcDNA3tyr质粒转染MSC后，采用Fontana硝酸银还原染色法检测体外细胞及体内组织的黑色素，为下一步酪氨酸酶基因转染MSC后MRI在体显像示踪奠定基础。　　 方法：　　 1.小鼠MSC的分离培养、扩增和纯化方法同第一章。　　 2.pcDNA3tyr质粒转染MSC以脂质体法按照LipofectamineTM 2000试剂盒说明转染。　　 3.细胞黑色素染色。转染后BM-MSC培养24h后行Fontana硝酸银还原染色法进行染色。电镜、光镜下观察黑色素分布　　 4.组织黑色素染色。　　 4.1 实验分组。　　 4.2 细胞输注。　　 4.3 小鼠存活状况观察。　　 4.4 组织黑色素染色。　　 结论：　　 1.pcDNA3tyr质粒转染MSC，可以在细胞内产生黑色素。　　 2.转染后MSC输注小鼠，可以在组织内检测黑色素。　　 3.移植后小鼠7天内生长状况良好，显示转染pcDNA3tyr质粒的BM-MSC输注无明显的毒副作用。　　 第四章、酪氨酸酶基因质粒转染MSC后体外细胞及小鼠体内MRI显像。　　 目的：将酪氨酸酶基因体外转染MSC，输注体内后以MRI技术在体显像，可以直观、无创性地长期在体示踪-MSC的归巢和定植，得到清晰的MSC定植的解剖生理图像，为探索MSC辅助造血的机制提供良好的实验平台。　　 方法：　　 1.小鼠MSC的分离培养、扩增和纯化方法同第一章。　　 2.体外细胞MRI显像。　　 2.1 pcDNA3tyr质粒转染MSC分别取10μg空白pcDNA3质粒、5μg、10μg、20μgpcDNA3tyr质粒以脂质体法按照LipofectamineTM 2000试剂盒说明转染BM-MSC。　　 2.2 MSC MRI显像胰酶消化后获取细胞悬液(各约106个细胞)，1500r/min离心5min使之沉淀于离心管底，仔细吸除上清后将1-4号离心管平行放置，分别代表空白对照及含5μg、10μg、20μgpcDNA3tyr质粒的细胞团。并行T1WI、T1WI/SPIR、T2WI序列检查。　　 3.小鼠MRI显像。　　 3.1 pcDNA3tyr质粒转染MSC。　　 3.2 转染后MSC移植小鼠。　　 (1)实验分组。　　 (2)细胞输注。　　 (3)实验小鼠存活状况观察每日观察小鼠活动力、外表、饮食、大便、体重等，记录每组死亡率。　　 4.统计学处理。　　 采用SPSS11.5统计软件包进行统计分析。单因素方差分析各种细胞在T1WⅠ、T2WⅠ、STIR扫描序列的信号强度总体间的差异，以最小有意义差异(least significance difference，LSD)-t检验观察上述3个扫描序列中各细胞间的信号强度两两间差异是否具有显著性。P＜0.05表示差异具有显著性。　　 结论：　　 1.pcDNA3tyr质粒转染MSC后，生成的黑色素可经MRI显像。　　 2.pcDNA3tyr质粒转染MSC并输注小鼠体内，经MRI发现肝脏黑色素显影成功，提示活体示踪的可行性。　　 全文结论：　　 1、成功建立了MSC体外分离培养和扩增体系。　　 2、脂质体法能够成功将pcDNA3tyr质粒转染MSC，转染前后MSC的生物学特性不受影响。　　 3、移植后小鼠7天内生长状况良好，显示转染pcDNA3tyr质粒的MSC输注无明显的毒副作用。　　 4、pcDNA3tyr质粒转染MSC后，在胞内产生黑色素，可经MRI显像。　　 5、酪氨酸酶基因介导的MRI在体显像示踪有其可行性。