套细胞淋巴瘤pHBLV-CCND1/IgH-CAR慢病毒表达载体的构建与鉴定

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目的:构建含有套细胞淋巴瘤特异性融合基因CCND1/IgH的嵌合抗原受体慢病毒表达载体pHBLV-CCND1/IgH-CAR,为制备pHBLV-CCND1/IgH-CAR-T细胞提供实验条件,为MCL探索新的免疫治疗方法奠定实验基础。  方法:TRIZOL法从jeko-1细胞中提取总RNA,经RT-PCR法获得CCND1/IgH基因,将其测序结果与NCBI Genbank中的CCND1/IgH基因序列进行比对,确定其内含有 CCND1/IgH 基因;根据 CCND1 和 IgH 基因 CDS 区序列,全基因法合成CCND1/IgH 融合基因;利用重叠延伸 PCR 法将 CCND1/IgH 融合基因和Hinge-TM-CD28-CD3 ζ 片 段 直 接 相 连 , 得 到 CCND1/IgH-CAR 片 段 ; 将CCND1/IgH-CAR片段克隆至慢病毒载体pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen的EcoRI和BamHI酶切位点,得到pHBLV-CCND1/IgH-CAR质粒;该质粒经双酶切及测序鉴定后与psPAX2质粒和pMD2.G质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,用包装好的慢病毒感染293T细胞,测定病毒滴度。  结果:CCND1/IgH融合基因与Hinge-TM-CD28-CD3ζ片段经重叠延伸PCR法拼接后得到嵌合抗原受体CCND1/IgH-CAR;目的片段CCND1/IgH-CAR和慢病毒载体通过双酶切后连接,得到pHBLV-CCND1/IgH-CAR质粒;pHBLV-CCND1/IgH-CAR质粒经菌落 PCR、DNA 测序验证后构建正确;三质粒共转染法成功包装慢病毒pHBLV-CCND1/IgH-CAR,病毒滴度为2×108TU/ml。  结论:成功构建嵌合抗原受体pHBLV-CCND1/IgH-CAR 慢病毒表达载体,为制备pHBLV-CCND1/IgH-CAR-T细胞提供了实验条件,为恶性淋巴瘤的过继免疫治疗以及提高CAR-T疗法的精准性提供了有价值的参考资料。
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