研究背景随着社会经济的发展，饮食结构发生了很大的变化，由此导致的血栓性疾病也成为全球健康的头号杀手。其中冠心病（Coronary Heart Disease, CHD）的致死率约为13%左右，尤其是心肌梗死（Myocaridal Infarction, MI）的发生率呈上升趋势，严重威胁了人类的寿命和生活质量。而目前对冠心病的治疗方式均无法从根本上挽救已经坏死的心肌。一般认为，心肌细胞是终末期细胞，在心肌受到损害后无法自行修复。如何挽救坏死的心肌细胞改善心脏功能成为当今研究的重点，近年来随着对干细胞（Stem Cells）的研究发现将干细胞诱导分化为心肌细胞后可以修复梗死区域的坏死心肌并且能够改善心功能，这一研究为终末期心脏病患者带来了新的曙光。在干细胞中，骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs）以具有自我更新能力、多向分化潜能及易于获得等特性而成为当今干细胞研究的热点。但是随着对干细胞的研究的深入，研究者们发现干细胞在体外培养传代时同其他体细胞一样都存在着细胞衰老的现象，这一现象严重阻碍了干细胞的临床应用，因此如何解决这一问题成为医学研究者共同的目标。研究目的1.探讨大鼠BMMSCs体外分离培养、生长与传代并观察各代BMMSCs的增殖规律和特点。2.明确miR-17-5p在衰老及正常大鼠BMMSCs中的表达变化规律与差异性。3.研究miR-17-5p对大鼠BMMSCs增殖周期的影响和调控作用。研究方法1.细胞培养、细胞计数与鉴定：采用差速贴壁法联合密度梯度离心法分离培养大鼠BMMSCs，并传代纯化培养至第10代。取第4代（P4）至第10代(P10)BMMSCs用流式细胞仪分别进行表面抗原CD29、CD44、CD45鉴定。倒置显微镜动态观察各代细胞形态学的变化并记录，将各代细胞进行计数并绘制增殖曲线。2. BMMSCs细胞衰老检测：取第4代（P4）BMMSCs至第10代(P10) BMMSCs用β-半乳糖苷酶（β-gal）染色法分别进行染色，以检测出衰老细胞。3.细胞转染与MTT法：将P10BMMSCs接种于24孔板中，分为空白对照组（P10-CON），转染试剂对照组（P10-Xtrem）实验组（P10-mimics）,每组细胞设有三个复孔，将miR-17-5p-mimics转染入试验组中，于细胞孵箱内培养48h后开始进行细胞计数及MTT法检测，并绘制细胞增值曲线。4. PCR技术及流式细胞检测技术：采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测正常与衰老BMMSCs中miR-17-5p基因的表达情况及转染48h后3组细胞中miR-17-5p的表达量，并用2（-ΔΔct）法定量分析。饥饿培养P10-CON组及P10-mimics组细胞，令其同时进入细胞周期后，使用流式细胞仪检测两组细胞的细胞周期。研究结果1.各代BMMSCs形态学变化：P4至P10的BMMSCs细胞形态发生明显改变，P4BMMSCs形态均一，呈典型的漩涡状生长，P10BMMSCs失去典型的梭形外观，细胞体积增大而不规则，形状扁平，细胞间隙增大，出现衰老现象。流式细胞仪检测P4至P10BMMSCs表面标志抗原CD44和CD45，结果显示:各代BMMSCs的CD44阳性表达率90%以上，CD45阳性表达率为3%以下。2.细胞生长曲线及增殖规律：P4-P10BMMSCs及P10-mimics组细胞生长曲线，均呈S形。第1、2d细胞生长缓慢，为潜伏期；第3-5天细胞增殖加速，数目呈指数级增长繁殖，为对数生长期；培养第6d细胞数目达峰值，增殖速度减慢进入平台期，细胞数目相对稳定；P4-8BMMSCs增殖良好，P9-10BMMSCs增殖不良，第6天，P10最为显著（P <0.05）。P10-mimics组在接种24h后细胞数量无明显改变，细胞处于停滞期，在对数生长期时，P10-mimics组生长最快（P <0.05），P10-mimics组在第7d时细胞数量仍在继续缓慢的增长。3. BMMSCs细胞衰老检测：P9至P10BMMSCs经β-gal半乳糖苷酶染色呈蓝色（阳性），提示此时细胞为衰老细胞。P4至P8BMMSCs经染色β-gal半乳糖苷酶染色后未着色（阴性），提示此时细胞为正常细胞。4. BMMSCs miR-17-5p基因的表达状况：P4BMMSCs miR-17-5p基因的表达量是（2.7784±0.1052）bp为P10BMMSCs中的6.5倍（P <0.01）。细胞转染48h后，P10-mimics组miR-17-5p表达量是（1.32365±0.231）bp为P10-CON中的2.9倍（P <0.05）。5. miR-17-5p对BMMSCs细胞周期的影响：饥饿培养48h后添加血清，3组细胞G0/G1期细胞百分比分别降低了P10-CON组53.16%、P10-Xtrem组50.64%和P10-mimics组51.47%,且三组之间无明显差异（P>0.05）；3组S期细胞均有升高，可见有G0/G1期细胞进入S期，以P10-mimics组最为显著（P <0.05）。P10-mimics组细胞从G0/G1期顺利进入S期，促进细胞生长增殖；3组细胞从S期进入G2期，以P10-mimics组最为显著（P <0.05）；3组细胞增殖指数分别为P10-CON组65.44%，P10-Xtrem组54.405%和P10-mimics组83.85%，P10-mimics组约为P10-CON组的1.28倍，（P <0.05），说明P10-mimics组的增殖能力强。研究结论1.利用差速贴壁联合密度梯度离心的分离方法，能获得较高纯度的BMMSCs，通过检测BMMSCs的表面抗原可以鉴定，BMMSCs在体外多次传代的过程中可以保持较高的纯度。2.衰老BMMSCs中miR-17-5p的表达量显著降低，提示miR-17-5p可能参与了细胞的衰老过程。3. miR-17-5p能够促使BMMSCs由G0/G1期进入S期，改变细胞周期，从而提高细胞的增殖能力延缓细胞衰老状态和进程。